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[求救] 14kDa的蛋白一直壓不到

看板Biotech (生命科學)作者 (等待)時間13年前 (2012/08/25 22:43), 編輯推噓11(11推 0噓 19→)
留言30則, 16人參與, 最新討論串1/1
我要看的蛋白大小約14kDa,但不知道為啥就是一直壓不到 (抗體確定ok) 試了好多方法，也換過membrane材質，就是一直壓不出來 (連一點背景都沒有!完全空白!) 所以想上來請教大家，請大家能給我一些意見!!拜託~ 我的transfer buffer配方 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, 20% methanol 沒有調pH值，配完直接用 semi-dry跟濕式兩種都試過 濕式 400mA或300mA, 一小時 semi-dry 0.8mA/cm2, 一小時或15V, 45分鐘 (這條件是爬文過參考其他板友的建議) membrane無論是NC還是PVDF也都試過 (兩種用的都是0.22的) 以上條件通通壓不出來 (崩潰 T.T) 我曾試著把sample拿給我同學，請他幫我做WB (抗體也是我給他的) 結果他用濕式400mA, 一小時 竟然可以壓出來!!!!! (徹底崩潰~~) 我跟他只差二抗不同，transfer buffer配方也是一模一樣 後來我還跟他要了一點二抗 (因為想說會不會是我的二抗壞了) 其他條件完全照他的，結果還是一樣崩潰!!!!!!!!! 大概壓了不下十次以上了吧~始終找不到optimal的條件 真的不知道是哪裡出了問題 想請問大家，無論是濕式或是semi-dry，我用的條件是OK的嗎? 可是其他人都能壓到<20kDa的，為什麼我都壓不到 T.T 抗體出問題? 可是請我同學幫忙，結果也OK 本身細胞表現量不高? 可是我上q-PCR，Ct值幾乎跟GAPDH一樣 實在想不出來還有什麼地方有問題了 還是要再提高methanol的濃度呢? 可以請有經驗的大家救救我吧~那是我的target protein，一直壓不出來真是生不如死阿~ 麻煩大家了 (鞠躬~) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.24.70.217
推
08/26 01:14, , 1F
你確定proteins transfer 到membrane了?
08/26 01:14, 1F
→
08/26 01:15, , 2F
懷疑, 您是不是把電接反了?
08/26 01:15, 2F
→
08/26 01:16, , 3F
先檢查SDS-PAGE是否跑好, 再檢查是否轉過去membrane?
08/26 01:16, 3F
回alaric大，我可以很確定電極沒有接反耶，因為同一片membrane，GAPDH都壓得出來 SDS-PAGE跑的時候看起來也沒什麼異狀，所以應該不是電極接反的問題
推
08/26 01:29, , 4F
SDS-free Meth提高到30%試試
08/26 01:29, 4F
謝謝martyrtitan大的建議，我再試試看~
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08/26 01:33, , 5F
幾%的SDS-PAGE?
08/26 01:33, 5F
10%跟12%的SDS-PAGE都試過了
推
08/26 02:12, , 6F
q-pcr是RNA的表現，時間點應該比protein早不少
08/26 02:12, 6F
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08/26 02:14, , 7F
另外transfer完拿膠去染coomassie blue看有沒有你的band
08/26 02:14, 7F
我也有染過coomassie blue了，如果是semi-dry, 55kDa以下的幾乎都不在gel上了 這樣的話應該也代表我的蛋白也跟著過去membrane了吧?
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08/26 04:42, , 8F
不要再改條件了,直接去同學的實驗室跟著做一遍比較實在
08/26 04:42, 8F
推
08/26 07:37, , 9F
也許根本不是轉的問題 這種半乾條件一定都會過去阿
08/26 07:37, 9F
恩~理論上來說確實這樣的條件應該都會過去，但我想說是不是已經過頭了~ 因為壓出來的片子是清清如水，連一點背景都沒有 ※ 編輯: nk12914 來自: 114.24.70.217 (08/26 10:09)
推
08/26 11:52, , 10F
墊兩層就知道啦
08/26 11:52, 10F
回m大，其實也試過墊兩層，marker 11kDa確實會跑到第二張mambrane，但還是壓不到蛋白
推
08/26 12:13, , 11F
你有染ponceau S確認嗎...
08/26 12:13, 11F
有耶，blocking前都會先染，確實在26kDa以下的部分比較染不太到 ※ 編輯: nk12914 來自: 114.24.72.212 (08/26 16:00)
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08/27 00:30, , 12F
膜改用GE這牌,transfer時間縮半(有過即可,不用全過)
08/27 00:30, 12F
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08/28 00:12, , 13F
底片空白?顯影劑失效?呈色劑失效?
08/28 00:12, 13F
推
08/28 00:33, , 14F
跟著做一次比較保險 直接用眼睛看比較準
08/28 00:33, 14F
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08/28 00:34, , 15F
很多的細部差異用口述很難告知
08/28 00:34, 15F
推
08/28 02:02, , 16F
淚推...我懂版大的苦!!!
08/28 02:02, 16F
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08/28 07:38, , 17F
實驗做不出來 有很多很多因素 有時候是不被發覺的地方
08/28 07:38, 17F
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08/28 07:38, , 18F
比如電源供應器的穩定性 建議你直接去你同學的實驗室做一次
08/28 07:38, 18F
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08/28 07:40, , 19F
排除是操作問題後 再一個一個試 比如借 buffer 借器材
08/28 07:40, 19F
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08/28 07:41, , 20F
pH 值有時候也會影響 如果 pH meter 不準的話
08/28 07:41, 20F
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08/31 14:53, , 21F
我之前也有壓過14KD的,不要跑太久速度要調慢,不然會跳海
08/31 14:53, 21F
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08/31 14:55, , 22F
不建議用Semi-dry 常常都轉不過去
08/31 14:55, 22F
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08/31 14:58, , 23F
濕式我有時候會讓他overnight或4小時以上喔!!!
08/31 14:58, 23F
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08/31 16:57, , 24F
那可以請問福爾摩沙大~你的transfer條件是多少? 謝謝~
08/31 16:57, 24F
推
09/06 23:48, , 25F
考慮提高SDS-PAGE濃度至18%, 或是確定CBR後可以看到你要的
09/06 23:48, 25F
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09/06 23:50, , 26F
基本是每條bands 14kD附近, 最好要清晰可分辨.
09/06 23:50, 26F
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09/09 15:02, , 27F
semi-dry不適合transfer小分子蛋白，用濕式比較適合
09/09 15:02, 27F
推
09/12 23:02, , 28F
400mA 20V 害怕過頭就加兩張membrane
09/12 23:02, 28F
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09/12 23:06, , 29F
之前有別的實驗室都壓不出來,結果是沒有用二次水配
09/12 23:06, 29F
推
09/26 13:00, , 30F
我也有差不多的痛..可是我連GAPDH都爆炸了 囧
09/26 13:00, 30F
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