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[求救] miRNA的篩選

看板Biotech (生命科學)作者 (oleic)時間13年前 (2012/09/03 09:40), 編輯推噓5(5推 0噓 28→)
留言33則, 5人參與, 最新討論串1/1
想請問一下 要如何在萃取出的眾多RNA中 找到自己想要的miRNA? 另外就是 miRNA的長度並沒有很長 在做RT 以及PCR的時候 PRIMER是如何黏貼上去的? (有查到兩個方法 一個是利用Oligo(T)特異序列的PRIMER 另一個是 利用looped Primer 可是如何能確定做出來的東西是我們想要的 難道不會隨便亂黏嗎?) 最後一個是 SAMPLE裡面的 normalization 是指? 小弟剛進實驗室 然後老闆就丟了個miRNA相關的東西給我 希望我能弄出個大概的實驗流程 (而且實驗室之前也沒有人做過RNA相關 所以也沒有學長姐可以問 Orz) 看了PAPER之後 目前預計的流程應該是: 自SAMPLE萃取RNA (KIT有分 取TOTAL RNA或者是取small RNA 屆時應該是用後者) ↓ 反轉成cDNA ↓ real-time PCR ↓ 計算Ct值 謝謝指教 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.71.2.84
推
09/03 10:54, , 1F
通常你要先有一個你想看的gene, 再以prediction軟體去
09/03 10:54, 1F
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09/03 10:54, , 2F
預測有哪些miRNA可能target你的gene
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09/03 10:55, , 3F
normalization就是平常說的"標準化"在這裡是指用snoRNA
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09/03 10:56, , 4F
或其他在細胞中表現stable的small RNA作為control
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09/03 10:59, , 5F
我RT用的方法都是looped primer你可以參考TaqMan miRNA
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09/03 10:59, , 6F
assay中RT的介紹
09/03 10:59, 6F
推
09/03 11:05, , 7F
prediction軟體在網路上很多, 像是TargetScan, microRN
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09/03 11:06, , 8F
A.org, PicTar.. 等
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09/03 11:12, , 9F
如果sample少的話建議用Ambion的Cell-to-Ct kit來抽RNA
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09/03 11:13, , 10F
從cell lysis到翻RT不像一般需要沉澱或wash, 所以不用
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09/03 11:14, , 11F
擔心會有RNA lose
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09/03 11:16, , 12F
做miRNA所要用的reagent都比較貴, 建議先評估值不值得
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09/03 11:16, , 13F
砸這筆錢下去!
09/03 11:16, 13F
推
09/03 11:40, , 14F
先說明你的樣本，不同物種處理方法差很多
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09/03 11:41, , 15F
建議你直接跟幾個大廠產品專員去討論
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09/03 11:41, , 16F
畢竟很多miRNA相關的實驗跟一般實驗用的東西名稱很像
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09/03 13:06, , 17F
SAMPLE 預計是用唾液以及血液
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09/03 13:12, , 18F
是要看secreted miRNA?
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09/03 14:39, , 19F
是想看有沒有特異性的miRNA 能代表特定體液
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09/03 15:10, , 20F
或許要做miRNA array..
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※ 編輯: otneiv 來自: 203.71.2.84 (09/03 16:20)
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09/03 16:23, , 21F
這樣的話 應該要請廠商幫忙? (實驗是好像沒有相關儀器)
09/03 16:23, 21F
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09/03 16:28, , 22F
而且價格應該不斐 = =a (老闆應該會希望有比較便宜的方法)
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09/03 16:36, , 23F
我之前問過TaqMan miRNA array 四個sample要價八萬
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09/03 16:37, , 24F
多問幾間有在做miRNA array的廠商看看吧!
09/03 16:37, 24F
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09/03 16:41, , 25F
感謝幫忙!! 我再跟老闆討論看看好了~~
09/03 16:41, 25F
推
09/03 17:22, , 26F
榮陽也有做Taqman miRNA array，價格差不多就是了Orz
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09/03 17:23, , 27F
也可以試試mirDIP先做幾個db的比較，做起來比較有信心
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09/03 17:24, , 28F
其實幾個db的預測結果出入也不小，尤其是PicTar很特立獨行
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09/03 18:12, , 29F
我想應該是萃取sRNA後跑NGS之類的定序 然後走
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09/03 18:15, , 30F
deep sequencing 然後再篩出可能的miRNA
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09/03 18:16, , 31F
通常還會搭你想要看的array去分析patten
09/03 18:16, 31F
推
09/04 00:12, , 32F
找已知的用array，有商品化的很好用
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09/04 00:13, , 33F
找未知，解NGS，無論哪種就先學抽RNA，QC過才能往下做
09/04 00:13, 33F
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