[求救] bacterial colony hybridization
先簡單敘述一下我的實驗:
1.我有一個 PCR product跑GEL結果是smear，但推測其中有我要的片段
2.我將PCR product做TA clone，送入ECOLI塗plate長colony
3.我嘗試找出帶有某特定片段的colony並將他送定序
(dna序列可推測而得之，但定序前無法100%確定)
目前方向是利用colony hybridization (bacterial)
找的protocol是來自 Molecular Cloning
簡單敘述一下流程
1.利用membrane沾一下plate上的clone
2.利用paper帶有buff黏上membrane進行破菌粹DNA
3.讓DNA binding
4.之後就同southern
我的問題是:
因為以 Molecular Cloning 上的 denaturing solution
中有個東西lab沒有，只有一個功能相近的東西
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guanidinium thiocyanate ， guanidine hydrochloride
確定的是功能都是denature protein，但不確定的是在這份protocol可不可以取代
想請問大家意見。
另外就是
如果改找別份protocol，有版友有做過，推薦哪份protocol嗎?
(目前問了一下，好像都沒人做這實驗.......)
或是有哪些細節需要注意的....
非常感謝各位
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (09/06 17:18)
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09/06 18:17, , 1F
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09/06 18:19, , 2F
09/06 18:19, 2F
感謝
其實我原本就是用colony PCR
但因為PCR product是smear，即使我先gel purify切下我要的片段大小區域
再進TA clone
出來的colony也是有很多不是我要的
colony PCR只能確定insert的片段size而已，無法確定該片段是不是我要的
(因為我要的該段序列我只能"推測"他的序列，再真正定序出來前無法100確定他的序列
所以如果是primer落在insert內部的方法就不可行....)
原本是考慮用colonyPCR看insert size，接著在用enzyme digest再check一次
size都對就送定序做最後確定
但老師覺得這種方法太亂槍打鳥了(或是太花錢?)
於是才叫我做colony hybridization........ ㄒ_ㄒ
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (09/07 09:54)
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (09/07 09:56)
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09/07 10:56, , 3F
09/07 10:56, 3F
但那部份是先做出TEMPLATE然後用random primer做出probe
所以實際上我不太需要知道他確切的sequence，而是靠這樣做出probe
這邊是我個人的理解...
還是其實有其他方法我沒想到??
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (09/07 14:49)
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