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[求救] 回收切過的質體

看板Biotech (生命科學)作者 (soso)時間13年前 (2012/10/05 16:55), 編輯推噓5(5推 0噓 13→)
留言18則, 7人參與, 最新討論串1/1
小弟我把pUC19用SmaI切4小時 之後跑膠然後回收!!! 未切跟切過的pUC19有一起跑膠檢查過大小是不一樣的(1.5 kb vs 2.7 kb) 但是如果直接拿切過的pUC19作transformation 到E.coli 結果還是會有大量的菌落..請問這是因為我pUC19沒切好嗎?? 還是細菌自己會做ligation..... 亦或我要補做CIP?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 134.76.70.252
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10/05 17:07, , 1F
EtBr下看到未切的位置沒訊號不代表沒pUC19,要考慮影像極限
10/05 17:07, 1F
※ 編輯: adamada 來自: 134.76.70.252 (10/05 17:42) ※ 編輯: adamada 來自: 134.76.70.252 (10/05 17:44)
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10/05 17:45, , 2F
我只有切2.7那邊回收膠所以我不懂blence您的回答??
10/05 17:45, 2F
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10/05 17:50, , 3F
沒切好 另外enzyme有極限 不應該假設100%都切乾淨
10/05 17:50, 3F
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10/05 17:51, , 4F
所以有的人會喜歡在常用的plasmid的MCS裡面放一段DNA
10/05 17:51, 4F
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10/05 17:51, , 5F
這樣用enzyme切的時候 有切乾淨跟沒切乾淨的位置差很遠
10/05 17:51, 5F
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10/05 17:52, , 6F
用這種方式減少沒有切乾淨的DNA的汙染
10/05 17:52, 6F
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10/05 17:53, , 7F
然後細菌的確會自己做ligation 不然怎麼做DNA repair
10/05 17:53, 7F
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10/05 18:10, , 8F
所以要怎樣做才叫有切好??畢竟切過跟未切過的大小差了1kb.
10/05 18:10, 8F
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10/05 18:30, , 9F
不是DNArepair就能end-joining,而且Ecoil的EJ還需要Rec活性
10/05 18:30, 9F
推
10/05 23:06, , 10F
不管怎樣做，都沒有100%切乾淨的可能，切好否看你的定義
10/05 23:06, 10F
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10/05 23:06, , 11F
切過跟沒切過大小也沒有差，那只是circular/linear差別
10/05 23:06, 11F
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10/05 23:07, , 12F
你沒看到，不代表膠體內完全不含circular form plasmid
10/05 23:07, 12F
推
10/06 23:46, , 13F
我有一個疑問, pUC19有兩個SmaI切位嗎?
10/06 23:46, 13F
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10/07 04:24, , 14F
pUC19只有一個SmaI!
10/07 04:24, 14F
推
10/07 16:46, , 15F
SmaI為blunt end，有看到兩個片段（可能為supercoil）表示
10/07 16:46, 15F
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10/07 16:46, , 16F
八成沒切乾淨
10/07 16:46, 16F
推
10/08 12:53, , 17F
酵素切 O/N 吧.
10/08 12:53, 17F
推
11/12 22:01, , 18F
你的pUC19有做過antibiotic的test嗎?你確定colony是pUC19
11/12 22:01, 18F
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