[求救] protein已定量但actin卻不equal?
各位大大好:
近來我在收取Western blot所需的細胞lysate後 以Bio-rad protein assay這組kit進行
定量後發現actin還是不甚equal 仍須用肉眼判定量的多寡來微調
想問一下是不是我實驗的哪個步驟出了問題
我所使用的藥物是會導致細胞死亡的藥物 最高劑量大概可以使整盤p10的細胞死亡60~70%
而我收取lysate的步驟如下:
=> 用細胞刮勺將細胞刮下後 連上液(medium)一同加入離心管中
=> 將細胞離心下來之後 PBS wash一次
=> 細胞pellet加入 HNTG lysis buffer回溶(此步加入protease inhibitor)
=> 冰負80度C 一小時以上或overnight後 放在4度C shaker上搖晃一小時
=> 13000rpm 30分鐘
=> 取上液負20度C保存
定量步驟如下:
使用BCA標準品 0.125, 0.25, 0.5mg/ml 並使用ddH2O當作blank
Sample四倍稀釋 18ul ddH2O + 6ul sample
每一well加入10ul 並加入200ul Bio-rad protein assay 抽吸15次確保mix均勻
使用ELISA reader 570nm測定
在之後的計算中 我每次蛋白質的定量在標準品所畫出來的公式線r平方值都在99以上
但是換算出來後 使用Western去看 發現actin還是不太equal 尤其是加藥高劑量的那一組
想請問是不是在我收lysate的過程中有哪一步驟是錯誤的導致裡面有其他蛋白也跟kit反
應而被定量到了呢?
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