[求救]in situ for crysection slide

看板Biotech (生命科學)作者pent (愛、失敗、死亡)時間13年前 (2012/11/05 16:41)推噓1(1推 0噓 3→)

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實驗室的protocol是用石臘包埋的slide做ISH(in situ hybridization) 大致作法如下，殺老鼠，用DEPC-PBS perfuse, 4% PFA(depc水配製) fix, 4%PFA泡overnight(~16hr) 再泡在50%酒精，送包埋，切片，拿到slide，脫臘，接著 depc-pbs 洗三次， 0.2N HCl 20min depc-pbs*3, proteanase K RT treatment, 再洗三次，4%PFA fix, 洗三次 Triethanolamine(TEA) buffer+acetic anhydride treat RT 10min 再洗三次(DEPC-PBS) pre-hybridization 58。C 1-2hr DIG-probe 58。C hybridization, 第一天結束第二天，2X SSC/50% formamide 65度C wash 15min*2 1X SSC/50% formamide 65度C wash 30min*2 接下來就是用 anti-DIG的antibody from Roche 1:500去認 2% NBT/BCIP呈色, 大概要等15-30分鐘才有顏色吧 sample 是心臟，我用cryosection slide做不出來連positive control 也沒顏色後來看到一篇current protocol，它把cryosection slide，先用4%PFA RT 先固定20min DEPC-PBS wash *3, 接著30%, 60%, 80%, 90%, 100%酒精2min treat, 它說這樣可以固定tissue，並且，我在版上找到，dehydration和rehydration可以增加組織的通透性，所以我也有試了一次，依然失敗，依然連positive control都沒訊號我真的想不出有哪個地方有問題，probe是同事幾個月前合的 RNA probe 用in vitro transcription做出來的一、兩個月前，實驗室的人用石臘包埋的心臟組織還是做的出來 cryosection的sample要怎麼做ISH呢？這些步驟有沒有哪裡有漏，懇請版上的高手救救我 thanks -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.40.72