[求救] western 結果毛毛的訊號不強

看板Biotech (生命科學)作者worldsky (不知要用啥???)時間12年前 (2013/04/22 15:10)推噓4(4推 0噓 2→)

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發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 大家好小弟最近在做western的實驗，遇到了鬼打牆的瓶頸...T_T 我的protein在經過X光壓片後，會出現如以下圖的狀況... 圖片連結：http://ppt.cc/gZaF (X光片壓片時間1分鐘) 我的protein們會毛毛的但是隱隱約約還可以看見其中的band... 感覺就是protein有點散開有出現光暈的那種FU 而且相同的protein以前壓的時候大概30秒訊號就很夠了而且很集中但是現在要壓到3分鐘訊號還沒有那麼強而且散開又糊糊的但是PVDF上面的marker卻是很sharp，沒有糊掉的狀況想請問各位版上的大人們是否可以給小弟一點建議指點一下迷津因為困擾了很久想說來向各位前輩們求教了感激不盡以下為我的western 條件 protein loading 量: 30 protein loading 體積: 20-30 uL 開始跑膠前，會先pre-run: 80V 10min Running條件: 60V upper gel, 80V lower gel, 總共時間~150min，室溫 ↓ Transfer條件: 300 mA, 2 hour, 0.45孔徑的PVDF, 埋在冰塊裡面轉漬 ↓ Blocking: 5% BSA or 5% skim mlik, 室溫1小時 ↓ Wash: TBST with 0.1% tween-20, 5次, 每次5分 ↓ 1st Ab: 稀釋倍數如廠商建議量，4度C, overnight ↓ Wash ↓ 2nd Ab: 稀釋倍數10,000-20,000x，確認二抗沒有用錯 ↓ Wash ↓ 壓片：片子在投影片上擺好，ECL先混好再淋上去，擦乾多餘的ECL，蓋上投影片壓片 (洗片為自動洗片機，自動洗片機確認沒有問題，因為其他實驗室同學都OK) 有勞各位前輩了真的是萬分感激小弟在這邊先向各位致上最高的的謝意感激不盡!!!!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.96.75

[求救] western 結果毛毛的 訊號不強

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