[求救] Western Blot 訊號很髒或是沒有訊號
小妹我之前在台灣做Wetern Blot沒有遇上這些問題...
怎知道到了新實驗室之後就一直debug不了，希望各位出手相救 >"<
目標是要偵測分子量約140的蛋白
☆ 問題1:壓片時background超高!
試過改變blocking condition如下:
5%脫脂牛奶, 5% BSA, 5%FBS, 4度o/n, 或是 室溫 2~3 h 的排列組合
Buffer都是TBST
試過100V transfer 2h 或是 0.03A 4度 o/n
改變過washing的時間，從10min 3次到洗的天荒地老 (大約2~3h)
改變過2nd Ab濃度從1:1000到1:10000 室溫2h
以上方法都沒有用...
但是只要學長stripping掉重新染就很ok很漂亮
我問過學長的condition是5%牛奶室溫1h, wash基本上約45分鐘,2nd Ab 1:10000室溫2h
1st Ab都是Cell Signaling的rabbit polyclonal
☆ 問題2:大分子量蛋白消失!
這次是做 22V 冰箱中 transfer O/N, transfer完的液體還是涼的(biorad濕式)
同樣一片PVDF裁開，上半部染我要的target, 下半部染tublin
壓片時只有看到tublin的訊號
後來用ponceu S染PVDF,確定在大分子量那邊看不到band, tublin的band倒是很明顯
marker完整的到PVDF上，沒有殘留在膠上也沒有透到濾紙那邊
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以上兩個問題沒有同時發生，
但是我真的已經不知道該怎麼做了...
不知道提供的資訊是不是夠詳細，請大家幫幫忙救救人在國外孤苦無依的孩子
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 98.201.148.218
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圖在學校，明天補上
與TARGET SIZE相近甚至更大的marker都有完整的transfer過到PVDF上
我跟學長用的是同牌不同管，但我本身換過兩管了都是這樣...
我還換過SANTA CRUZ也一樣
※ 編輯: Kat0503 來自: 98.201.148.218 (06/26 12:10)
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有，我是照學長的量
他壓的時候SIGNAL超強的! 都還要等他稍微decay才能壓得漂亮
我們試過跑同管sample，但是他的就ok我的就不行... > <"
※ 編輯: Kat0503 來自: 98.201.148.218 (06/26 13:37)
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推
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已經乖乖的把protein sample交出去給學長請他試試看~
然後已經約好時間要用他全套的東西跑一遍!
目前決定把所有buffer砍掉重練...
重配buffer之後如果還有一樣的問題可能就真的要再繼續找問題點了
※ 編輯: Kat0503 來自: 98.201.148.218 (06/27 12:16)
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