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[求救] western blot internal control

看板Biotech (生命科學)作者 (打完回老家結婚)時間12年前 (2013/06/27 17:59), 編輯推噓1(1推 0噓 20→)
留言21則, 6人參與, 最新討論串1/1
因為要壓量比較少的 protein 需要 load 大量的 sample，大概 100ug 但 internal control 的部分，會黏在一起 well 與 well 間分布清楚，導致無法定量 有試過 actin 跟 tubulin 都會這樣 也試過把 sample 量降到 80ug 不過不只要壓的 protein 很淡很模糊 internal control 也還是會黏在一起 想請教版上的大大們有沒有人知道 有什麼表現量比較少的 internal control 或是經過什麼處理可以解決這個問題 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.115.48.65
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06/27 18:49, , 1F
internal control另外跑一片 loading 5ug/well這樣
06/27 18:49, 1F
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06/27 23:02, , 2F
可以這樣做喔!!
06/27 23:02, 2F
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06/28 00:02, , 3F
internal control 通常都是表現量海量的 house keeping
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06/28 00:03, , 4F
gene， 我會建議試試看把inter control的一抗稀釋更多倍
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06/28 02:15, , 5F
有建議得量嗎 我目前試過用1:3000 跟1:1000效果差不多
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06/28 02:16, , 6F
差別只在曝光時間要在久一點 但lane的寬度不變 是不夠稀
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嗎?
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06/28 02:26, , 8F
我們家actin和tublin都是1:10000以上
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06/28 06:52, , 9F
lane寬度不論抗體怎稀釋都不會變啊...因protein分佈就那樣
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06/28 06:54, , 10F
另外跑一片然後註明都是同一管sample 但loading不同量即可
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06/28 10:49, , 11F
這是因為滿出來了吧 不能改變loading量的話 建議改跑
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06/28 10:50, , 12F
大片Gel 另外跑一片 感覺起來有點 "奇怪"
06/28 10:50, 12F
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06/28 11:06, , 13F
看原PO老闆接不接受吧...也可以每兩格well才load一個sample
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06/28 11:07, , 14F
中間空well load 1X sample buffer以隔開
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不過同一批sample如果要看超多種protein, 不可能全部只跑
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一片然後通通看完
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stripping也有次數限制
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06/28 13:47, , 18F
也只好問問老闆答不答應了
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06/28 13:47, , 19F
謝謝各位大大
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推
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再跑一張+1 通常一個sample要跑個三四張
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06/29 20:49, , 21F
才有辦法依據蛋白質的表現量用出適量的western條件
06/29 20:49, 21F
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