[求救] medaka冷凍切片及 HE染色(已爬文過)(急)

看板Biotech (生命科學)作者dearetet (忙碌者~)時間12年前 (2013/07/29 19:24)推噓1(1推 0噓 7→)

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各位大大好現在我在做 medaka 的冷凍切片及 HE染色 (之後要繼續做免疫染色、骨骼染色及細胞凋亡的染色) 但是卡在，切片一直都切不好，切片前處理條件一直試不出好的結果 (組織都會破損)(主要觀察腦和眼睛) 版上的方法有參考(畢竟sample不是medaka)網路的資料也參考過，但切出來就是都不好以及HE染色，染色前和染色後，組織會有破損的情況，有時切片甚至在染的時候切片會掉下來(只有一部分) 所以在此想問問各位大大，有沒有建議的切片前處理和HE染色的步驟，或是其他染色的步驟在下方我會列出我切片的處理方式和HE染色的步驟，不知是否可以修正的地方 (本來想附上照片，但照片很多，有需要看照片的，可以提出，謝謝!) 先感謝大大! 一、切片前處理 1. 4% (paraformaldehyde)PFA + 30% sucrose，RT，8H，用Rocking shaker 30 rpm 用OCT包埋，直接放入 -80 ℃冰箱小於30分鐘後切片。厚度10 um，溫度-15 ℃。 2. 4% PFA + 1X PBS + 5% sucrose + 33%OCT ， 4度C，1H → 4% PFA + 1X PBS + 10% sucrose + 33%OCT ， 4度C，1H → 4% PFA + 1X PBS + 30% sucrose + 33%OCT ， 4度C，O.N 用OCT包埋，直接放入 -80 ℃冰箱，2H後切片。厚度10 um，溫度-15 ℃。 3. 5% sucrose ， 4度C，1H → 10% sucrose ， 4度C，1H → 20% sucrose ， 4度C，1H → 30% sucrose ， 4度C，1H 用試鏡紙將水分吸乾用保鮮膜包住sample 放入 - 20度C 2H 放入 - 80度C 4H 將鋁座用OCT做一個平台，OCT變白後，再加入一點OCT，趁OCT未變白前，將sample放好並擺好位置，再用OCT將SAMPLE完全包埋住，OCT變白後切片厚度10 um，溫度-15 ℃。 4. 5% sucrose ， 4度C，1H → 10% sucrose ， 4度C，1H → 20% sucrose ， 4度C，1H → 30% sucrose ， 4度C，1H → 50% sucrose ， 4度C，3H → 用試鏡紙將水分吸乾用保鮮膜包住sample 放入 - 20度C 2H 放入 - 80度C 4H 將鋁座用OCT做一個平台，OCT變白後，再加入一點OCT，趁OCT未變白前，將sample放好並擺好位置，再用OCT將SAMPLE完全包埋住，OCT變白後切片厚度10 um，溫度-15 ℃。 5. 5% sucrose ， 4度C，1H → 10% sucrose ， 4度C，1H → 20% sucrose ， 4度C，1H → 30% sucrose ， 4度C，1H → 50% sucrose ， 4度C，3H → 4% PFA ， 4度C，1H 用試鏡紙將水分吸乾用保鮮膜包住sample 放入 - 20度C O.N 放入 - 80度C 2H 將鋁座用OCT做一個平台，OCT變白後，再加入一點OCT，趁OCT未變白前，將sample放好並擺好位置，再用OCT將SAMPLE完全包埋住，OCT變白後切片厚度10 um，溫度-15 ℃。 6. 5% sucrose ， 4度C，1H 10% sucrose ， 4度C，1H 20% sucrose ， 4度C，1H 30% sucrose ， 4度C，1H 50% sucrose + 4% PFA + 1X PBS + 33% OCT ， 4度C，3H 用試鏡紙將水分吸乾用保鮮膜包住sample 放入 - 20度C O.N 放入 - 80度C 2H 將SAMPLE 取出，放入裝有OCT的TUBE蓋子中，擺好位置後，放入-15度C(切片機溫度)，變白後切片厚度10 um，溫度 -15℃ ※切出來的切片直接用玻片貼片，全部切完後直接染色或放入4度C冰箱保存 --------以上是後期試過的方式，結果都不讓老師滿意，怎麼做可以更好呢?---------- ※HE染色將切好的切片從4度C冰箱取出並回溫 ˙玻片用(冰醋酸 5ml +甲醇95ml) 固定30秒。 ˙用DD water清洗玻片，將玻片稍微擦乾。 ˙以Hematoxylin染5秒。 ˙用DD water清洗玻片，將玻片稍微擦乾。 ˙處理85% Alcohol 1分鐘。 ˙再用Eosin 染5秒。 ˙用DD water清洗玻片，將玻片稍微擦乾。 ˙用95%、100% Alcohol各脫水1分鐘。 ˙放入100% Xylene 10分鐘後封片(蓋玻片與Permount)。這樣染色的步驟需要修改嗎? 第一個步驟用(冰醋酸 5ml +甲醇95ml) 固定30秒會掉片是因為這步驟的關係嗎?拉長時間會比較好嗎? (老師覺得不是這一步驟出問題) 問題很多~先感謝大大提出一些建議~我已經測試了兩個月了~希望可以繼續下去! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 192.192.199.49 ※ 編輯: dearetet 來自: 192.192.199.49 (07/29 19:25)

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