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[求救] 關於colony PCR之問題

看板Biotech (生命科學)作者 (塵世中一個迷途小五六)時間12年前 (2013/08/06 18:06), 編輯推噓3(3推 0噓 4→)
留言7則, 5人參與, 最新討論串1/1
如題 要把A plasmid上的基因片段 接到 B plasmid上頭 A B兩種plasmid上都有CMV promoter 基因片段(A plasmid)為2K Vector(B plasmid)為8K 原PO的實驗步驟如下 1.restriction enzyme digestion 使用XbaI 和 NheI兩個酵素同時作用 overnight 切Vector和 insert 因為XbaI 和 NheI的切位可以互相接起來 所以我使用了CIP處理Vector 2.Ligation 隔天將DNA片段經由gel extration後ligation 接著塗盤養overnight 以1:3 molar ratio Ligation 3.colony PCR 隔天長出菌落之後做colony PCR 以CMV primer作為forword 以基因上有的序列設計primer作為reverse 因為不管在A plasmid上還是我的新construct都是以CMV poromoter接著我的目標基因 所以我以A plasmid作為 positive control 大約300bp 但我的新construct卻P出一堆雜band 與positive control不符 挑了大概六十顆 結果完全相同 無法解釋這個現象 跪請版上強者幫忙 謝謝... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.40.39
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08/06 20:19, , 1F
挑60顆,我覺得一個construct挑超過6顆,重做比較快
08/06 20:19, 1F
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08/06 20:22, , 2F
8k,應該是viral vector吧,如果是,看colony大小就能先排除了
08/06 20:22, 2F
推
08/06 21:57, , 3F
有做vector only control嗎?
08/06 21:57, 3F
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08/06 22:53, , 4F
CIP處理需要改進，做不好容易這種結果
08/06 22:53, 4F
推
08/08 10:10, , 5F
一樓專業
08/08 10:10, 5F
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08/08 10:12, , 6F
另外雜band多 可以調高annealing temperature試試
08/08 10:12, 6F
推
08/14 11:35, , 7F
請問viral vector 的colony是會比較小嗎? but why?
08/14 11:35, 7F
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