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[求救] 關於shRNA knockdown效果

看板Biotech (生命科學)作者 (空)時間12年前 (2013/08/15 23:52), 編輯推噓5(5推 0噓 21→)
留言26則, 9人參與, 最新討論串1/1
大家好，小弟我最近實驗遇到些問題 我用shRNA 去knockdown，前面的塗盤養菌都OK 1.抽plasmid，濃度和定序OK 2.transfect到293細胞，螢光OK(24hr有50%) 3.抽RNA，濃度OK 4.RT-PCR 5.QPCR 但是QPCR的結果: CT值感覺沒有什麼變化 看不出K.D.的效果 請問大家有沒有遇過類似問題~或是有什麼好的解決方式~ 謝謝大家~ P.S.shRNA序列是參考ABI公司的序列 -- Can you hear me ☆ ███ ◢█◣◢█◣ ██ █ █★◢█◣▄█ you bring me joy ☆ █ ██████ █▄ █ █ █ █▄█ you bring me love ★ █ ◥████◤ █ ███ ◥█◤ █ You are my everything to me █ ◥██◤ ★ ██ █ █ ☆ ▅ You are my everything to me ███ ★ ◥◤ ψcrli █ █ ████ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.195.162.84
推
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RT-PCR有看出差異嗎？
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推
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這可能性太多了,扣除技術性問題,最可能的就是這個shRNA不work
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一般都是作好幾個shRNA看哪個work,效果最好
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比較保險的作法是找paper有證實的shRNA來用
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如果是照著一般guideline來設計, 就要多作幾個
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通常1個target會設計約5個shRNA去試
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RT-PCR沒什麼差異
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我一個target設計3個~總共有2個target~可是兩個都沒有
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看出Knockdown的效果
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還是有可能他們都不Work~還在想是要重新transfect
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還是應該要重新再設計shRNA
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我選的序列是abi公司做過的~他們也做過可以成功
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所以兩個還是太少嗎?
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謝謝你們的回應~
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你現在還會覺得shRNA比較省嗎? :)
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如果序列是自己接的，很可能是銜接的設計不對
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推
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同樣的序列在不同細胞上的效果會不相同
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可以嘗試RNAicore的shRNA，個人覺的非常省又好用
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推
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順帶請教一下，若RNA有Knockdown但protein level沒差異，通常
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會再做那些測試呢? 還是逕行使用其他shRNA?
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你 transfect 後多久做 cell lysis?
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Protein 如果半衰期比較長，就算 RNA 減少了還是能再
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細胞中持續存在一段時間。
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推
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三天72h。如果是半衰期長的protein，用RNAi knockdown的方法要
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探討後續功能變化是否不可行? 有甚麼管道可以搜尋是否為半衰期
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長的protein嗎?
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