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[求救] Tag cloning

看板Biotech (生命科學)作者 (半乳醣凝集素)時間12年前 (2013/09/09 17:31), 編輯推噓2(2推 0噓 15→)
留言17則, 7人參與, 最新討論串1/1
各位前輩們好，我想constract一個 overexpression 的plasmid，但這個基因沒有市售抗體，所以想要在我的 insert中加入Flag當作tag，想請問前輩們是否只要在 foward primer當中，在stop codon前面直接加入gat tac aag gat gac gat gac aag就可以了? (我目前是把stop codon拿掉) 但這樣一來foward primer就會有過長的問題，若是加上9個 Res site及21個mer，再加上flag就會有54個mer，這樣是否 會影響PCR效率。 有看到版上前人比較推薦flag tag，想請問是否在C treminal 接flag比較不會影響蛋白結構呢? 麻煩前輩們幫我解答，感激。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.60.122.10 ※ 編輯: galectin 來自: 210.60.122.10 (09/09 17:34)
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09/09 18:30, , 1F
做了才知道啦 都是這樣
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09/09 19:21, , 2F
許多方法,1.是去找已經有tag的vector,2是先用兩條primer做
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09/09 19:23, , 3F
anneal之後塞vector,或用site-direct塞,3.是你這樣一起併做
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09/09 19:24, , 4F
先tag塞進vector的好處是以後做cloning就可以用得到
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09/09 19:26, , 5F
至於N或C的影響，真的是做了才知道
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09/09 22:57, , 6F
我以前常做跟你一樣的設計，primer品質要稍注意
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09/10 15:40, , 7F
謝謝各位前輩，因為已經有選好載體了，所以只能外加
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09/10 15:42, , 8F
我打算選用生工primer的page純化，不曉得品質好壞
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09/10 15:43, , 9F
想再請問一下，Foward有30mer，Reverse 54個mer
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09/10 15:44, , 10F
有必要把F也補齊到50個mer左右嗎
09/10 15:44, 10F
推
09/14 18:35, , 11F
tm值差異小於1~2度應該就可以了 我是把所有序列都算進去
09/14 18:35, 11F
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09/14 18:36, , 12F
有的protocol會只算會黏上去的部分...
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09/14 18:38, , 13F
primer可以用 禾鑫的HAP純化 2 O.D 1mer/10元 ~3-5工作天
09/14 18:38, 13F
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09/14 23:27, , 14F
如果怕影響結構的話可以考慮加個linker在中間
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09/14 23:29, , 15F
54mer還好啦~我有一隻86mer的primer.. 而且是high GC
09/14 23:29, 15F
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09/14 23:30, , 16F
照樣P得出來~ 或者考慮加一點DMSO進去解掉二級結構~
09/14 23:30, 16F
推
09/15 09:44, , 17F
可以直接加入 primers 裡，我都這樣。
09/15 09:44, 17F
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