[求救] 想請教一下Annexin V/7AAD跑Flow

看板Biotech (生命科學)作者truthPP (就是真理)時間12年前 (2013/09/21 21:37)推噓4(4推 0噓 6→)

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各位這裡的賢拜大家好最近因為要做細胞凋亡情形監測的實驗目前實驗室現有的材料是 PE-Annexin V 7-AAD 故打算以此兩種現有材料對細胞進行雙染上Flow 但因為我自己本身大多做單染比較多做雙染的經驗很少有爬過文參考先前賢拜的方法但設計過程仍有些問題上來請教目前protocol暫定設定如下凋亡細胞以UV以及誘發細胞凋亡藥物引發凋亡 1.各組取前置細胞數1x10^6 2.將細胞離心後以PBS Wash 1次 3.將細胞回溶於Annexin V binding buffer 100ul 4.加入Annexin V 10ul以及7AAD 5ul在冰上進行15分鐘染色 5.各管加入400ul binding buffer直接上機組別部分分為 Control部分(活細胞) 1.不染control 2.Annexin V+7AAD雙染 control Positive control部分(死細胞) 1.Annexin V+7AAD雙染 2.Annexin V單染 3.7AAD單染實驗組 1.UV treat後細胞雙染 2.藥物濃度A Treat後細胞雙染 3.藥物濃度B Treat後細胞雙染上flow後的校正(X軸訂為FL2-H Y軸為FL3-H) 1.先上雙染control調整至左下角象限 2.上positive control 單染annexin V看是否會出現於左下及右下象限 3.上positive control 單染7AAD 看是否會出現於左下以及左上象限 4.上Positive雙染觀察細胞坐落象限是否正確 5.上不染control看setting有沒有跑掉問題點: 1.Protocol的部分Annexin V和7AAD可同時加入進行染色嗎? 因為有看過別家實驗室的Protocol是先染Annexin V 15mins之後再加入7AAD 但也有看過同時加的想請問這樣的用意差在哪邊? 2.染色時一般來說要在冰上還是室溫比較好? 一種說法是冰上可以防止Protein degrade 一種說法則是室溫時蛋白質的活性比在冰上好而且只染15分鐘室溫應該不太會有太大影響 3.實驗設計Control組的部分要以活細胞為設計對象應該沒錯吧? 因為自己本身想法是活細胞 PS不會外翻不會接上Annexin V 膜也完整 7AAD不會染到核故以活細胞作為Control 4.Positive control的設計條件是我比較傷腦筋的想請問一下各位這邊會讓細胞怎麼死?要死的多極端? 還是直接拿其中一組實驗組做positive control? 5.Flow設定調整校正順序是否有需要調整的地方? 另外就是因為是雙染可能會調整到compensation 在這邊有做過的賢拜大多是調整FL2H-FL3H%還是FL3H-FL2H? 有耳聞Annexin V+7AAD雙染設定調整是關鍵也非常不好調麻煩有做過的各位指導小弟一下非常謝謝!!!! 為表感謝回文或推文回覆者均給予200P -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 112.105.98.121