[求救] 胺基酸的衍生化

看板Biotech (生命科學)作者divingfish (潛水的魚)時間12年前 (2013/10/17 20:51)推噓0(0推 0噓 5→)

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各位版友大家好：我第一次做胺基酸衍生化，目標是將gama aminobutyric acid經PITC(phenyl isothiocyanate)衍生化後以HPLC分析定量。但依照paper上的protocol作衍生化，一直得不到預期的結果。參照的步驟如下： Standard derivatization (減壓離心濃縮去除溶劑的過程：37 °C) ˙50λ標準品(0.0125, 0.025, 0.05 mg/mL) 減壓離心濃縮到透明 ˙加入20λ coupling reagent (methanol:water:triethylamine 2:2:1) ˙混和後減壓離心濃縮到透明 ˙加入30λ PITC reagent (methanol:water:triethylamine:PITC 7:1:1:1)，於室溫下反應20分鐘 ˙減壓離心濃縮去除PITC (eppendorf有白色固體殘留) ˙PITC衍生物以500λ bufferA回溶 ˙經0.2λ Millipore membrane過濾 HPLC analysis ˙column: C18 reversed-phase column (Nucleodur 100-5 C18 ec 5U, 250 x 4.6 mm) ˙operating temperature 43°C ˙UV absorption spectrum：254 nm ˙以gradient進行分析 Buffer A： 0.1 M ammonium acetate Buffer B： 0.1 M ammonium acetate:acetonitrile:methanol (44:46:10, v/v/v) BufferA、bufferB皆以acetic acid調整pH到6.5 時間 buffer A 比列 0-12.5 min 100-75% 12.5-25 min 75-50% 25-37.5 min 50-25% 37.5-50 min 25-0% HPLC圖譜中沒有標準品的peak。想請問是否有版友做過胺基酸的衍生化，可以給一些建議，或是操作上需要注意的地方。謝謝> < -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.89.39