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[求救] Southern blot 詭異的背景

看板Biotech (生命科學)作者 (mitosi)時間12年前 (2013/10/25 11:20), 編輯推噓1(1推 0噓 15→)
留言16則, 4人參與, 最新討論串1/1
最近剛開始接觸southern blot, 用的是thermoscientific的kit, biotin labeled probe, 但在最後都會發現membrane上有一半的background就是深色的，而且不管怎麼hybridize, 怎麼blocking，那個背景值只存在於整張membrane的1/2(即上部分，well 那裡開始)。 如圖http://imgur.com/DOOEU5h
我很好奇到底是什麼原因造成partially background的產生 是因為transfer的時候所導致，還是? 感謝各位有經驗的大家分享寶貴的意見~~ 不然我就沒有辦法繼續troubleshoot了! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 137.132.228.5 ※ 編輯: mitosi 來自: 137.132.228.5 (10/25 11:24)
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I建議you寫Chinese就好好寫 片子明顯是呈色問題
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可能是membrane的問題
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chl大謝謝你的寶貴意見 不過由於都是學術專有名詞所以我還
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是傾向於用英文注寫 怕翻譯不好 所以請您多多包涵
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我是不知道為什麼會分兩半，但一般來說是因為你沒有把ECL
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滴乾淨就包起來去壓片，然後你的ECL可能很Sensitive，一些被
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洗下來游離的二抗就在你包起來的區域裡面游來游去。
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建議是把ECL滴乾淨一點。訊號有就是有，沒有就是沒有，不差
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那幾分鐘。
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但是我們以前用DIG壓出來的band其實都肥肥的，你可以考慮
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增加DNA loading的量，讓訊號增強，就可以減少壓片時間，
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還有你的DNA是不是很髒 還一堆卡在well上下不來？
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因為那個是total DNA所以會卡在上面，而且我的protocol裡沒
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有說明要把peroxidase洗掉 所以呈色的時候就沒洗
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推
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我跑total DNA 還是從植物組織抽的 也不會卡啊...
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可以試試看先純化出細胞核再抽DNA 多一天而已
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