[求救] pcr產物長度有問題

看板Biotech (生命科學)作者 (meimei)時間12年前 (2013/11/15 16:31), 編輯推噓3(3016)
留言19則, 8人參與, 最新討論串1/1
實驗內容: 將細胞養在dish,加入不同藥物濃度,作用後 抽取total RNA 進行RT-PCR,得到cDNA 再進行PCR擴增我要的片段 我預設跑膠後的結果 會是 不同藥物濃度處理後的細胞所得到的片段 應該會是大小一樣 濃度會不同 但實際跑出來的結果 是片段大小會有差距 而且是比原先預設的片段大小還大 為什麼會有這樣的結果? 是引子設計有問題嗎? 還是cDNA有問題? 不知道有沒有人有經驗作過的 幫幫忙解個答 謝謝哩 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.26.145.230

11/15 16:35, , 1F
會不會是你的藥物影響到你RNA的splicing?
11/15 16:35, 1F

11/15 16:42, , 2F
首先想到的可能性同樓上,去查包含有intron的mRNA長度
11/15 16:42, 2F

11/15 16:42, , 3F
跟你的產物比對一下?
11/15 16:42, 3F

11/15 16:48, , 4F
請問你們意思是說 alternation splicing嗎?
11/15 16:48, 4F

11/15 16:59, , 5F
發了發了 但是堵10000 p幣你老闆不敢繼續做下去
11/15 16:59, 5F

11/15 17:32, , 6F
賺到惹~~~定序看看~?
11/15 17:32, 6F

11/15 17:59, , 7F
再重複幾次吧 如果是那可能就是在splicing上的影響
11/15 17:59, 7F

11/15 18:00, , 8F
不過有做positive control嗎
11/15 18:00, 8F
加藥濃度是從0往上增加這樣 所以~是跟無加藥處理的DNA比較,位置不一樣

11/15 19:11, , 9F
把primer丟到 primaer-blast 看會有那些產物試試
11/15 19:11, 9F

11/15 19:12, , 10F
primer
11/15 19:12, 10F
我會去比對看看!

11/15 19:15, , 11F
看不懂兩個意思 得到cDNA library? 和mager band??
11/15 19:15, 11F

11/15 19:17, , 12F
或是 抽RNA時沒處理 讓genomic DNA 殘留
11/15 19:17, 12F
※ 編輯: bbiioo 來自: 111.252.239.8 (11/18 09:32)

11/18 09:33, , 13F
打錯了是major band
11/18 09:33, 13F

11/18 09:35, , 14F
genomic DNA可能有殘留 但引子設計有跨exon了..
11/18 09:35, 14F
※ 編輯: bbiioo 來自: 111.252.239.8 (11/18 09:39)

11/18 11:47, , 15F
請考慮產品長度,跨的intron長度說一下比較好討論,有些intro
11/18 11:47, 15F

11/18 11:50, , 16F
才100~200bp,不是有跨就沒問題
11/18 11:50, 16F

11/18 11:55, , 17F
另外是你做了幾次,換cell line? 定序了沒?
11/18 11:55, 17F

11/18 21:58, , 18F
恩 因為是不同cell line不同基因都有這現象
11/18 21:58, 18F

11/18 21:59, , 19F
我會再比對看看
11/18 21:59, 19F
文章代碼(AID): #1IXTlurC (Biotech)
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