[求救] Real-time PCR positive control無訊號

看板Biotech (生命科學)作者godinal (無心)時間12年前 (2014/01/14 14:10)推噓2(2推 0噓 15→)

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各位前輩好: 自從接觸Real time PCR後結果一直很不穩定, 想請問前輩們是否也有相關經驗可以稍微提點一下原本我只是負責幫忙出"手"趕data的人... 師父先找好條件後，由我和另一位前輩負責將樣品做完我們用的是ABI7000的機台，enzyme選用Roche fast hot start Taq enzyme 一開始先捉internal control之條件師父告知annealing 溫度為72度故反應條件則為 94度2分鐘, 1cycle 94度5分鐘, 1cycle 接下來40cycle則是 94度30秒, 72度1分鐘 total reaction volume 20ul, Taq enzyme0.3ul Ct值要嘛沒有不然就是38-40cycle才出來後來師父重新捉條件後，叫我把Taq enzyme改取1ul.... 測試一次正常後就開始找target gene的條件了最近重新回來做internal control之qPCR 師父說，他重新訂了primer(和原本序列一樣)， annealing溫度要改成64度 40cycle之條件改為 94度30秒 64度30秒 72度30秒 (hot start和上面一樣) 我就像鬼打牆一樣...positive control怎麼做都做不出來和我一起執行的前輩有做出來...但她的NTC也有訊號我試過很多次，也試過前輩用的primer , buffer 其中也有陸陸續續換過SYBR, Buffer, dNTP, primer, templete 怎麼做都沒有訊號不知大家有什麼建議...可以提供做為參考 PS: 酒精噴太多會造成干擾qPCR的結果嗎?? 雖然現在噴完都會等一下才開始執行開蓋的動作但實在想不出還有什麼會影響實驗結果的東西了還有一個問題...照理qPCR條件捉好後是否還是會變來變去啊?? 如果會...那要怎麼做半定量?? 如果不會....那會變來變去可能的原因是什麼呢? 煩請大家協助解惑感恩謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.96.146.51