[求救]酵素活性測試之lysis buffur 選擇
各位先見好:
小弟目前做的研究是用
化學分子探針標定細胞萃取液的蛋白質
探針的本身是 ligand-crosslinker group-tag 組成
目標蛋白質主要是 CYP450 膜蛋白(主要位在內質網與粒線體中)
從細胞萃取出來的蛋白必須是有活性 non-denuturing
與探針作用一段時間後才跑 SDS-PAGE 作分析
在此要求上 cell lysis buffer 選擇
市面上常見的 RIPA NP-40 由於含 SDS所以並不適合
而non-denuturing lysis buffer 又都含有 EDTA
(由於 EDTA會與 CYP中的 heme螯合會破壞該蛋白的活性)
因此打算自己配，參考文獻的配方如下
25 mM Hepes, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 7.5, 1% NP-40
要破的細胞是前列腺癌細胞 H295
步驟是加入萃取液後超音波震 5秒再放冰浴中 5分，重複此步驟 5次
不知道這樣的 lysis buffer配方會不會太溫和反而無法萃取出足量的蛋白呢?
感謝各位的意見
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