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[討論] in vitro system與細胞實驗 藥物劑量差異

看板Biotech (生命科學)作者 (Phil-Ku)時間11年前 (2014/11/11 17:50), 11年前編輯推噓2(2推 0噓 9→)
留言11則, 5人參與, 最新討論串1/1
由於最近在補一個藥物實驗的data 看到in vitro kinase assay覺得滿好玩的 就來嘗試看看 結果卻令人有點無法解釋: Compound A在kinase assay可以拉出正常的inhibitor log曲線 換算回去IC50為17 uM 但在細胞實驗中 只要2 uM的compound A 即可對此kinase p-Tyr level及其下游蛋白磷酸化有很顯著的抑制效果 (IP及WB已重複多次) 令我疑惑的是 通常都是細胞實驗或動物實驗的劑量 會大於IC50 of kinase activity劑量 (這還滿好解釋的 像是half-life等等) 但現在情況卻反過來 原廠是建議可以調整ATP濃度看看 能不能把log曲線往左右移動 (已經試過調整kinase量，對求得的IC50沒有顯著差異) 跑去問藥理跟藥學的同學 她們說還滿常碰到這種情形的 也只能把這個data收起來或再repeat看看 想請問一下各位專家們，碰到這種情況該怎麼解釋 或是有可以改變的條件讓兩種實驗的濃度不要差太多呢? 感謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.122.143.252 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1415699416.A.3D7.html
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11/11 22:01, , 1F
Kinase assay的原理是什麼呢?Sensitivity說不定比較差
11/11 22:01, 1F
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11/11 22:01, , 2F
也有可能是像原廠說的condition沒有抓得很好
11/11 22:01, 2F
我是用Progema的ADP-Glo system 簡易版步驟就是: kinase + inhibitor + ATP反應 然後再加入ADP-Glo這個reagent去反應 最後加入reaction buffer去測冷光 所以可調整的變因大概都在第一個反應那邊
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11/11 22:02, , 3F
也有可能compound A不太專一，在細胞內有別的效果出現
11/11 22:02, 3F
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11/11 23:12, , 4F
有沒有可能是進入細胞內compound A的量比出細胞的少
11/11 23:12, 4F
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11/11 23:12, , 5F
導致胞內外濃度差，所以實際胞內濃度已經遠超過2uM
11/11 23:12, 5F
這解釋也是有可能 但又要想實驗證明(默
推
11/11 23:48, , 6F
未必是direct target 到那個kinase上, 也可能透過indirect
11/11 23:48, 6F
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11/11 23:48, , 7F
作用, 如影響更上游 or 加強phoshatase功能等等
11/11 23:48, 7F
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11/11 23:49, , 8F
in vitro 做出來IC50是17uM應該沒有人會相信是真的on target
11/11 23:49, 8F
沒錯 這也是我覺得很恐怖的原因
推
11/12 00:06, , 9F
data永遠是對的(默)
11/12 00:06, 9F
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11/12 00:48, , 10F
其實整篇看不懂原廠指的是哪一個,compound? kinase? kit?
11/12 00:48, 10F
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11/12 00:50, , 11F
文中提到原廠建議調整ATP,你卻調整kinase,好像雞同鴨講
11/12 00:50, 11F
我第一次實驗先做了ATP conversion standard curve & 原廠建議的kinase量 發現偏高以後 將kinase量減半 其他條件相同 再做一次實驗 發現結果差不多 才致電原廠 並得到可以從ATP量下手的建議 XD ※ 編輯: waitingu (140.122.143.252), 11/12/2014 09:51:55
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