PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

Western band定量出的ratio不穩定（再現性差）

看板Biotech (生命科學)作者 (雪)時間10年前 (2015/02/02 21:59), 10年前編輯推噓8(8推 0噓 23→)
留言31則, 6人參與, 最新討論串1/1
大家好，有一事想請教 實驗室最近在建立Western，也快一年了 在其他常做Western實驗室人的鑒定下，也覺得我跑的結果很漂亮 但我發現一個問題，同一個樣本（已變性） loading至不同片膠跑出來的band，經internal contol校正計算出ratio 常常數值是不穩定的 即使是同時、進行相同操作的兩片膠仍是如此 詳細來說 由於我要比較的樣本量多 所以必須分散在不同片膠做 但我每片膠會load一個固定的樣本，我稱它作A 第一片膠(gel 1) load A B C 第二片膠(gel 2) load A D E 由於我的internal control和要看的蛋白質 位在不同張PVDF膜（原先是一張transfer完上下裁開） 冷光照相是分次照（不是同時收訊號） gel 1和gel 2也是分開來拍照 所以很可能會發生gel 1的A計算出的ratio是0.8 但gel 2的A則是0.6， 為了同時比較所有樣本，我會把每片的A校正成1.0 其他樣本依照和A的比例再作換算 例如gel 1 A(0.8) B(0.4) --> A(1.0) B(0.5) 　　gel 2 A(0.6) D(0.2) --> A(1.0) D(0.33) 如此就能把A當作媒介來比較位於不同膠上的樣本，理論上可行 但是我現在的問題，簡單來看就是把上面的D換成同樣是B 也就是明明都load同一個樣本，經校正後值卻不一樣 有的甚至差了兩倍 我問過很多實驗室 發現並沒有人真的去比較不同批次作結果是否相同 請問大家做的Western定量band再現性高嗎？ 還是Western定量本來就是不準確的？ 困擾已久，如有高人指正，不勝感激 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.154.121 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1422885580.A.C92.html
→
02/02 22:20, , 1F
loading前盡量vortex, pipetting均勻
02/02 22:20, 1F
有我十分謹慎
推
02/02 22:25, , 2F
請問樓上,加入SDS加熱100度C10分鐘,spin down,不就把
02/02 22:25, 2F
→
02/02 22:26, , 3F
sample全load進去,此時vortex或pipet會有差異嗎？
02/02 22:26, 3F
推
02/02 22:28, , 4F
我也遇到跟作者同樣問題(我做實驗約半年),通常倍率差不
02/02 22:28, 4F
→
02/02 22:29, , 5F
多的，跑出來甚至還不一致,除非是本來倍率就差很多,再現
02/02 22:29, 5F
→
02/02 22:30, , 6F
性才會比較好一些,所以我也發現有些實驗室會用技術的三
02/02 22:30, 6F
→
02/02 22:30, , 7F
重複來取代biologic重複
02/02 22:30, 7F
推
02/02 22:33, , 8F
我覺得western blot變異性真的很大,尤其對剛做實驗的人,
02/02 22:33, 8F
→
02/02 22:34, , 9F
等Simple Western比較平價跟普及之後,就會像QPCR逐漸取
02/02 22:34, 9F
→
02/02 22:34, , 10F
代電泳加上Image J定量的方式
02/02 22:34, 10F
我不停爬國外網文似乎也有外國鄉民說WB僅供半定量， 要更準確的話用qPCR或ELISA， 但WB做蛋白質定量的paper也很多 （我的target protein也是參考別人做過才決定採用WB） 所以想知道是我技術不好還是沒人正視這個問題？
→
02/02 22:35, , 11F
每片的A算出0.6或0.8，是跟internal ctrl比,WB的data來自
02/02 22:35, 11F
→
02/02 22:36, , 12F
Ab訊號的放大,因此不同片要得到相同ratio,很難排除Ab影響
02/02 22:36, 12F
→
02/02 22:40, , 13F
還有internal ctrl也是問題,有誰不是照出不飽和的band
02/02 22:40, 13F
ratio都是跟internal比，我用軟體確認band沒有飽和 （先前預實驗知道band過飽和會影響定量） internal control和target protein是分開來拍的（見上文） 所以我刻意讓internal拍照時間縮短、拍照次數增加 就可以避免band飽和，抓到最理想的照片
推
02/02 22:42, , 14F
只要是趨勢一樣 那數值浮動於.5-.33 說老實話 真的已經
02/02 22:42, 14F
→
02/02 22:43, , 15F
很完美了 如果真的要排除這個問題 考慮鑄15well的膠吧
02/02 22:43, 15F
→
02/02 22:44, , 16F
另外那麼多sample 除非是動物實驗或screen檢體否則真的
02/02 22:44, 16F
→
02/02 22:45, , 17F
建議看看能不能試著挑掉一些不重要的sample
02/02 22:45, 17F
我數值有差到兩倍的，感覺不是很穩定 做過六次計算出的CV值變異到30% 我的實驗動物個體差異較大，所以樣本多是必要的， 但15 well也塞不下...
→
02/02 23:07, , 18F
你有考慮改用ELISA做嗎？ 樣本多的話,這樣更快更好定量
02/02 23:07, 18F
我現在在考慮了，當初沒考慮用是因為 參考的paper都用WB（看同樣的target protein）
→
02/02 23:08, , 19F
我是認為動物sample品質很浮動 趨勢可以一樣就已經很棒
02/02 23:08, 19F
→
02/02 23:09, , 20F
了 significance有出來 就停手吧
02/02 23:09, 20F
→
02/02 23:10, , 21F
ELISA如果沒有commercial kit 想跨越技術門檻有點辛苦
02/02 23:10, 21F
你指的趨勢是說我實驗的"處理"間的趨勢嗎？ 不過我同一個樣本都不大穩定了， 樣本會盡量分散loading（也就是同一片上會同時比較不同處理） 每次做趨勢也不大一致（應該是定量不穩定的緣故） ELISA我有做過IgA的，只是不確定買一抗時 產品說明書是針對WB，是否可以通用？
→
02/02 23:11, , 22F
包含Ab1 Ab2 standard...最後curve還要能畫得出來 想到
02/02 23:11, 22F
→
02/02 23:11, , 23F
就昏了
02/02 23:11, 23F
→
02/02 23:14, , 24F
我們做drug screen看磷酸化蛋白,沒kit也都自己coating阿
02/02 23:14, 24F
我想到我恐怕不能用ELISA 因為我沒有我要看的target protein的標準品orz... 我的蛋白質是來自很少見的物種（台灣土雞），沒有商品T T 不管怎樣，很感謝樓上各位大大的建議 我煩惱很久了，還怕我問題太冷門要等好幾個月才有人回 我會再研究看看國外資訊，有沒有遇到相同問題
推
02/02 23:26, , 25F
如果你用相對量做elisa也不一定要絕對定量？
02/02 23:26, 25F
咦好像也對！我會try try看 雖然還是很想解決WB的疑惑
推
02/02 23:28, , 26F
另外借問一下有沒有人用96 well的sample lysate去做elisa
02/02 23:28, 26F
→
02/02 23:28, , 27F
? 試著做過但是s/n值好低 不知道是因為不是commercial ki
02/02 23:28, 27F
→
02/02 23:28, , 28F
t還是純粹sample太少
02/02 23:28, 28F
推
02/02 23:31, , 29F
我承認我曾經ELISA東西都備齊以後 看到前人慘痛經歷放棄
02/02 23:31, 29F
→
02/02 23:31, , 30F
coating(掩面)
02/02 23:31, 30F
我先前測IgA是自己coating，R2一直拉不好（弄一盤就兩天了） troubleshooting好幾個月最終才發現 原來是我用的96孔盤牌子有問題，換高檔的BD牌就0.99以上 便宜沒好貨，真的很無奈orz 連Western也是鬼打牆，感覺我做哪個實驗都被詛咒了XD ※ 編輯: snow122 (140.112.154.121), 02/02/2015 23:55:06
推
03/04 22:49, , 31F
有時候實驗就是這樣 別灰心了~
03/04 22:49, 31F
‣ 更多 snow122 的文章
文章代碼(AID): #1KpuBCoI (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 snow122 的文章
文章代碼(AID): #1KpuBCoI (Biotech)