PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] 斑馬魚成魚臟器RNA萃取

看板Biotech (生命科學)作者 (阿砲)時間10年前 (2015/08/03 15:27), 編輯推噓5(5推 0噓 32→)
留言37則, 6人參與, 最新討論串1/1
請問各位RNA神人們QQ 我近來需要萃取斑馬魚成魚胰臟進行Q-PCR的基因表現量定量實驗 所以理論上RNA的品質不可以太糟 而我們實驗室之前都只有在萃取斑馬魚胚胎的total RNA，而我已經有爬過文， 並且問過估狗大神怎麼抽斑馬魚的胰臟RNA了，可是沒有找到適合的方法 目前我使用的方法是: (取sample) 1.把成魚用低溫使其凍暈/死 2.利用水震盪過的鑷子以及剪刀將成魚從洩殖腔往前往上剪開 3.把魚皮剝掉後去除卵巢/精囊 4.把腸道上覆蓋的肝臟去除 5.把腸系膜剝除(斑馬魚胰臟分布位置) (RNA萃取) 1.把取出的樣品加入600ul Trizol用研磨棒磨碎 2.用24G的針頭來回抽取數次確認樣品非常的碎 3.再加入600ul Trizol 4.加入250ul chloroform 5.用votex的方法震盪到混和液是草莓牛奶的顏色 6.離心13500rpm,30min,4度C 7.抽取上清液到新的1.5cc tube 8.加入上清液一半體積的酸phenol，輕微搖晃混合靜置5min 9.加入和phenol等體積的chloroform混和均勻 10.離心13500rpm,30min,4度C (重複step7-10一次) 11.抽取上清液 12.加入1/2體積的salt(1.2M sodium Chloride, 0.8M Sodium Citrate) 和1/2體積的2-propanol 13.-20度C沉降20分鐘 14.離心13500rpm,20min,4度C 15.75%DEPC-EtOH wash pellet 16.抽風櫃中air dry 17.40ul DEPC-DDW回溶(60度C) (結果) con.(ng/ul) 260/280 pancreas RNA 1861 2.1 4dpf embryo 1369 2.1 RNA膠圖 http://imgur.com/ZjUJMwK
以上謝謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.130.98.167 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1438586868.A.3BF.html
→
08/03 15:33, , 1F
為什麼要做8~11的步驟阿?
08/03 15:33, 1F
推
08/03 15:40, , 2F
對阿 不是上清液加等量isopropanol然後離心沉澱RNA嗎@@?
08/03 15:40, 2F
→
08/03 15:52, , 3F
不做做8-11嗎? 因為Trizol/chrolform完介面層還是會有白
08/03 15:52, 3F
→
08/03 15:53, , 4F
白的東西 那些不是DNA汙染嗎?所以我們實驗室都會再用
08/03 15:53, 4F
→
08/03 15:54, , 5F
酸phenol過個一兩次，確定沒由白色絲狀物
08/03 15:54, 5F
→
08/03 15:55, , 6F
那個白色不是汙染而是本來就會有的東西
08/03 15:55, 6F
→
08/03 15:58, , 7F
http://0rz.tw/AP5Rk protocol有寫!!
08/03 15:58, 7F
推
08/03 16:05, , 8F
那個不就主要是變性的protein嗎?還幫你隔開上下層 超貼心
08/03 16:05, 8F
→
08/03 16:10, , 9F
蝦咪!!謝謝各位的指正 那請問我取樣品的方式有錯嗎??
08/03 16:10, 9F
推
08/03 17:07, , 10F
我有點好奇24G針頭來回抽吸gDNA會不會斷? 請樓下大大解惑
08/03 17:07, 10F
→
08/03 17:10, , 11F
斷了應該也沒差啦!! XD 有沒有錯主要看你上清取多少囉
08/03 17:10, 11F
推
08/03 17:56, , 12F
更正一下, 由於trizol是酸性,使得DNA會沉澱於interphase
08/03 17:56, 12F
→
08/03 17:58, , 13F
(離心後), 所以白色那層應該是protein/gDNA.
08/03 17:58, 13F
→
08/03 18:21, , 14F
多餘的步驟可以去掉。另外，步驟3/4之間和5/6之間，我家習慣
08/03 18:21, 14F
→
08/03 18:22, , 15F
放置一段時間，大約是5mins @ RT。在弄乾時，RNA 不要全乾，
08/03 18:22, 15F
→
08/03 18:23, , 16F
否則很不好回溶。對了，你 phenol 有另外調 pH 值嗎？
08/03 18:23, 16F
→
08/03 18:34, , 17F
還有，你的步驟12和一般用法不同，有什麼依據嗎？
08/03 18:34, 17F
→
08/04 00:00, , 18F
回I大我沒有另外調整phenol的PH值耶~我們都直接買PH4.5
08/04 00:00, 18F
→
08/04 00:02, , 19F
回a大我的上清液大概都會取500ul
08/04 00:02, 19F
→
08/04 00:03, , 20F
步驟12會用salt其實我不確定真正的原因，可是我去查有說
08/04 00:03, 20F
→
08/04 00:05, , 21F
法是鹽類可以幫助RNA析出，而且在萃取胚胎的RNA用我們的
08/04 00:05, 21F
→
08/04 00:05, , 22F
protocol可以在室溫完成全部的步驟
08/04 00:05, 22F
→
08/04 00:18, , 23F
我猜問步驟12不是要問用salt的原因,而是配方的依據何來?
08/04 00:18, 23F
→
08/04 09:39, , 24F
用Trizol本來就可以在室溫操作啦!!XD
08/04 09:39, 24F
→
08/04 09:40, , 25F
因為你的步驟加了很多Trizol protocol裡沒有的步驟
08/04 09:40, 25F
→
08/04 09:41, , 26F
我也很好奇這些步驟的來源是什麼，會問你上清取多少
08/04 09:41, 26F
→
08/04 09:42, , 27F
主要就是要避免取到白色那層，取500ul很安全啦!!
08/04 09:42, 27F
→
08/04 22:33, , 28F
to a大 其實那是我老闆之前modify出來的protocol 我今天
08/04 22:33, 28F
→
08/04 22:33, , 29F
有分別用兩個方法抽了斑馬魚的胰臟 並跑了RNA膠 如付圖
08/04 22:33, 29F
→
08/04 22:33, , 30F
08/04 22:33, 30F
→
08/04 22:34, , 31F
第一二條是我們實驗室的 第三條是trizol method 我現在很
08/04 22:34, 31F
→
08/04 22:34, , 32F
疑惑為什麼28s那麼暗 是因為dye嗎？
08/04 22:34, 32F
→
08/07 04:44, , 33F
我查了一下，你們的方法似乎是從1987年Chomczynske & Sacchi
08/07 04:44, 33F
→
08/07 04:51, , 34F
modified來的，網路上也一堆類似的方法。28S RNA 是被Xylene
08/07 04:51, 34F
→
08/07 04:52, , 35F
Cyanol 遮住没錯。下次可以減少dye的配量，或是改變 gel 的
08/07 04:52, 35F
→
08/07 04:54, , 36F
percentage。
08/07 04:54, 36F
推
08/27 07:43, , 37F
斑馬魚臟器夠小 直接塞trio 然後照步驟做就好
08/27 07:43, 37F
‣ 更多 myelroy 的文章
文章代碼(AID): #1LlnVqE_ (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 myelroy 的文章
文章代碼(AID): #1LlnVqE_ (Biotech)