[討論] Stripping對磷酸化蛋白的影響？
各位先進好
小弟最近在跑磷酸化蛋白的western blot
前天照出來的結果因為不是很好看，所以將membrane strip之後重新染一抗跟二抗
(stripping buffer是thermo的，我室溫strip 10~15分鐘之後，用1x TBST wash三次)
但重新染得這次用來配抗體的buffer不一樣，一抗濃度我也稍微提高了一些
(我用某公司提供的signal enhance buffer的sample來配一抗)
(一抗從1:1000提高到1:700)
結果如下
Stripping前（框出來的是我的target band）
http://imgur.com/T7aNvzR
Stripping後
http://imgur.com/BZ1xMOg
結果很詭異的是，Lane2濃度增強，Lane3濃度減弱
雖然這才是我要的結果，但stripping之後有這樣的改變我是第一次遇到
不知道版上的先進是否有什麼建議或看法呢？
變因有三個 1.buffer 2.抗體濃度 3.Stripping
我也會再跑一次試試看，用相同濃度相同buffer去看看是否會有一樣的結果
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.109.103.227
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會不會是strip太久@@?
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因為我怕二抗影響新的一抗，所以習慣上會Strip之後再染一次，所以可以不用strip嗎?
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我比較怕我用太多XD
※ 編輯: lxz (111.250.106.64), 08/14/2015 22:26:42
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我用imageJ統計過，第一次的Lane3確實比2高，我會重做第二次的條件，謝謝^^
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我是用5% BSA去blocking，Stripping是根據buffer裡說明書建議的時間去做，做過三次
確定有乾淨。
Strip後重染前？是指strip後的membrane的影像嗎？
我也在想是不是stripping造成磷酸根掉了QQ
※ 編輯: lxz (111.250.106.64), 08/16/2015 12:43:28
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來update一下
我後來用5% BSA配抗體，抗體用1:750，成功看到我要的結果，還沒試過stripping之後
是不是也會看到一樣的結果，但看起來應該是抗體濃度的原因。
謝謝大家:-)
※ 編輯: lxz (111.250.99.20), 08/23/2015 08:35:21
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08/27 21:15, , 14F
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