[求救] 細胞免疫螢光isotype control很明顯

看板Biotech (生命科學)作者 (缺少勇氣..)時間10年前 (2015/11/05 00:52), 編輯推噓2(2028)
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最近在做細胞免疫螢光, 主要是要染膜上的蛋白質, 一抗是Mouse / IgG2b, kappa 二抗則是rabbit antimouse igG接 Alexa Fluor® 488 因此我的ISOTYPE CONTROL就選擇Mouse / IgG2b, kappa, 但是結果出來Isotype control的螢光很明顯,尤其是在核的部分, 我的步驟是先做固定,染一抗, 染完一抗再用triton 100作permeabilization, 之後以4%BSA做BLOCKING,接著染二抗約一到兩小時, 不知道是為什麼結果出來Isotype control的螢光很明顯,尤其是在核的部分, 請各位大大指導一下, 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.161.20.186 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1446655926.A.276.html

11/05 01:58, , 1F
sample是細胞?組織切片?
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11/05 02:00, , 2F
染膜蛋白也不一定要用到Triton 固定完直接blocking
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11/05 02:02, , 3F
是細胞,因為最後有用Hoest33258染核,所以才加triton
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一抗1hr+二抗0.5hr即可(室溫之下)
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11/05 04:57, , 5F
換別種fix solution?
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11/05 11:41, , 6F
我是用4%的PFA當固定液,可以改什麼當固定液?謝謝
11/05 11:41, 6F

11/05 11:42, , 7F
好,我試試二抗放0.5hr
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11/05 12:48, , 8F
其他細胞染這隻抗體也會這樣嗎?(一樣是你操作的狀況下);
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11/05 12:48, , 9F
換隻二抗如何?
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11/05 12:49, , 10F
fix solution網路上找找就有,如methanol,但似乎不適用於
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膜蛋白的染色
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11/05 14:44, , 12F
我只有這隻細胞,我試試別只二抗看看
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11/05 23:43, , 13F
PFA固定染螢光易有background 建議換固定buffer
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-20度C的methanol或是acetone都可以
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11/06 00:23, , 15F
好,我下次試試看,感謝大家,做完再來跟大家報告結果!
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11/07 00:06, , 16F
我會在1抗前permeablize耶
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另外IgG可以,但不是最好的ctrl, 核內超強訊號不可避
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,很難去調整你的laser強度
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11/07 00:11, , 19F
你的膜上蛋白是endogeneous還是外送的呢?
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若是後者,可用無外送的細胞當ctrl,其次是用IgG,或只
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下二抗做對照
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染核我記得只要fix就可以了吧
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PFA易有background,可在blocking時輔以0.2M的glycine,
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可避免殘留的醛基對後續實驗的影響
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洗的時間拉長也可(我是10min*3次
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11/09 00:27, , 26F
我以前染核蛋白用aceton固定即可
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11/10 19:53, , 27F
各位大大,我今天加一個單獨二抗,結果背景蠻明顯,所以二
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11/10 19:53, , 28F
抗有問題
11/10 19:53, 28F

11/10 22:16, , 29F
所以你的實驗組呢,細胞核没訊號嗎?
11/10 22:16, 29F

11/10 23:06, , 30F
實驗組也是有訊號的,只是只加二抗的背景值就已經很高了
11/10 23:06, 30F
文章代碼(AID): #1MEZUs9s (Biotech)
文章代碼(AID): #1MEZUs9s (Biotech)