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[求救] blunt-end DNA ligation

看板Biotech (生命科學)作者 (可愛的Comomo)時間9年前 (2015/12/24 06:26), 編輯推噓0(0推 0噓 38→)
留言38則, 3人參與, 最新討論串1/1
我是第一次使用DNA ligase IV做blunt-end DNA ligation實驗 最近做了很多次，但一直做不出來>< 希望大家能幫我偵錯及給予一些建議！ 我的實驗步驟如下： 1. 準備ligation buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM DTT, 75 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 10% PEG10000) 2. 將Ku70/80及ligase IV/XRCC4加入ligation buffer後，置室溫15 min 3. 將p32-blunt-end DNA加入混合液中，置37度C反應1 hr 4. 加入stop loading buffer及95度C加熱5 min 5. Run 15% TBE-Urea gel, 然後壓片及顯影 謝謝大家！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 151.152.101.44 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1450909570.A.A7C.html
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12/24 10:18, , 1F
recombinant是自製的?
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12/24 12:34, , 2F
對，ligase IV/XRCC4 complex是自製的
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12/24 12:35, , 3F
Ku70/80也是
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12/24 13:53, , 4F
過這lig4如果是Ecoli會不會沒有活性,還是你用Sf9或invitro
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12/24 13:54, , 5F
如Hela lysate之類做的?
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12/24 14:58, , 6F
對了,你是只要接起來?要測in vitro NHEJ效率?還是只想看
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12/24 15:00, , 7F
lig4 activity? 如果是只看lig4/xrcc4,應該不必用ku70/80
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12/24 15:03, , 8F
設計nick就可以了?
12/24 15:03, 8F
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12/24 17:19, , 9F
你的DNA中P32 incorporate效率多高？有『多熱』？純化過？
12/24 17:19, 9F
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12/24 17:20, , 10F
壓片壓多久？壓片條件呢？
12/24 17:20, 10F
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12/24 17:21, , 11F
有失敗的片子可以看嗎？
12/24 17:21, 11F
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12/25 06:24, , 12F
謝謝大家的回應，我一起回答大家的問題。我是用SF9表達
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12/25 06:25, , 13F
的protein(E.coli的ligase4 complex沒活性嗎？)，我只是
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12/25 06:25, , 14F
想用lig4/XRCC4將blunt-end DNA接起來，另外，我不知inc
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12/25 06:25, , 15F
orporate的效率是多少^^''(如何檢測呢？)，但我有過G-25
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column去除free p32-ATP。我將gel浸泡在fixed buffer
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12/25 06:25, , 17F
內30 min後，乾膠及壓片24hr後顯影。最後失敗的片子上只
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有未修復的單股DNA訊號，而沒有連接起來的DNA訊號
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12/25 08:43, , 19F
lig4/xrcc4不小,用Ecoli可能folding會不OK;如果是接blunt
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12/25 08:48, , 20F
那用T4 lig可以排除P32 label問題,但是lig4的功能不是做為
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12/25 08:51, , 21F
blunt end ligation,而是NHEJ/Ku-dependent nick ligation
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12/25 13:07, , 22F
我的印象中，lig4在NHEJ pathway中扮演連接DSB的角色，
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12/25 13:07, , 23F
只是不知道為什麼in vitro的實驗一直做不出來，是不是步
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12/25 13:07, , 24F
驟出了問題？或有地方沒有做好？
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12/25 18:02, , 25F
你的ATP 是買gamma還是alpha？ 另外，再壓久一點呢？
12/25 18:02, 25F
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12/25 18:08, , 26F
怎麼會想要用SF9來表達細菌的蛋白呢？修飾系統完全不一樣。y
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12/25 18:08, , 27F
你有positive control嗎？例如T4 DNA ligase同時做來比較。
12/25 18:08, 27F
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12/25 18:49, , 28F
關於incorporate ratio的計算，我忘了，要再回去翻資料，和
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12/25 18:50, , 29F
通column前後的isotope值有關，希望你有留下計數資料。另外
12/25 18:50, 29F
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12/25 18:51, , 30F
拿去做ligation的specific activity是多少？或者說你拿多少
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12/25 18:58, , 31F
cpm/amount 進行ligation？
12/25 18:58, 31F
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12/26 12:22, , 32F
樓上完全搞錯了,Ku70/80及lig/xrcc4都是mammalian才有
12/26 12:22, 32F
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12/26 12:30, , 33F
原po是用Sf9表現人類蛋白;細菌NHEJ不是這些名字
12/26 12:30, 33F
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12/26 12:36, , 34F
我以為lig4/xrcc4跟lig1或lig3等最大差別不是接blunt end
12/26 12:36, 34F
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12/26 12:38, , 35F
而是Ku或其他factor recruited,所以會先懷疑這樣的
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12/26 12:41, , 36F
reconstructional是有人確認過,或有沒有需要其他factors
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12/26 12:43, , 37F
所以blunt end ligation分開成join 2end與nick ligate兩個
12/26 12:43, 37F
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12/26 13:46, , 38F
感謝b大指正。難怪這些名稱有些眼熟……
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