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[求救] 細胞計數

看板Biotech (生命科學)作者 (Right of Left)時間9年前 (2015/12/25 16:25), 編輯推噓4(4推 0噓 31→)
留言35則, 6人參與, 最新討論串1/1
大家好 想請問將細胞培養在基材上，想利用trypan blue計算 在基材上活細胞的數量，之間的過程會先用trypsin將 細胞取下然後與medium混合終止反應，接著直接使用 trypan blue進行計數沒有經過離心的步驟，這樣可以嗎? 基材的培養面積為4平方公分，加入的細胞為5萬顆，之前 幾次的實驗有經過離心誤差都滿大，有的組別甚至測不到 細胞數量，所以想說可能是離心完後細胞太少被我倒掉了。 請版友幫忙解惑 感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.116.159.183 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1451031943.A.8A8.html
推
12/25 18:17, , 1F
我們實驗室數細胞都不離心的，以打下來的濃度跟體積去計
12/25 18:17, 1F
→
12/25 18:17, , 2F
算總細胞數
12/25 18:17, 2F
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12/25 19:20, , 3F
樓上大大一樣使用trypan blue嗎?
12/25 19:20, 3F
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12/25 21:19, , 4F
是trypan blue沒錯!
12/25 21:19, 4F
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12/25 22:46, , 5F
OK 那我就不離心分離trypsin，直接計數試看看 感謝
12/25 22:46, 5F
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12/26 00:50, , 6F
我們也不離，除非細胞濃度不夠，才會2000rpm 2分鐘然
12/26 00:50, 6F
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12/26 00:50, , 7F
後抽掉一部分上清液再重算
12/26 00:50, 7F
推
12/26 00:56, , 8F
突然發現，推116 XDD
12/26 00:56, 8F
推
12/26 17:35, , 9F
想順帶問問，數完也不離心直接再種回去培養嗎？
12/26 17:35, 9F
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12/26 21:32, , 10F
trypsin→medium回溶→全吸起來→加要的量(0.5-1ml)到
12/26 21:32, 10F
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12/26 21:32, , 11F
新盤→剩的放離心管，再取50uL+50uL trypan blue來數
12/26 21:32, 11F
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12/26 22:48, , 12F
好奇一問：medium終止trypsin反應有多少體積比的根據
12/26 22:48, 12F
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12/26 22:48, , 13F
嗎？
12/26 22:48, 13F
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12/27 22:02, , 14F
1:1也可，重點在你養的細胞對trypsin敏不敏感，normal
12/27 22:02, 14F
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12/27 22:02, , 15F
cell建議利用離心移除trypsin再進行實驗。
12/27 22:02, 15F
推
12/27 22:42, , 16F
我們實驗室trypsin：medium會到1：3
12/27 22:42, 16F
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12/27 22:43, , 17F
如果非癌細胞的話，會加入trypsin覆蓋後吸掉，放incubat
12/27 22:43, 17F
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12/27 22:43, , 18F
or反應
12/27 22:43, 18F
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12/28 08:31, , 19F
加入trypsin又吸掉是為了什麼?
12/28 08:31, 19F
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12/28 08:32, , 20F
既然這樣何不加少一點
12/28 08:32, 20F
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12/28 16:25, , 21F
個人感覺：液態太少沒有覆蓋基材，反覆吸沖會產生泡泡
12/28 16:25, 21F
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12/28 16:54, , 22F
反覆吸沖的目的是？ 體積太少是覆蓋不了,但體積多到可以
12/28 16:54, 22F
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12/28 16:55, , 23F
那輕拍搖晃一下就夠了,沒有反覆吸沖的需求阿
12/28 16:55, 23F
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12/28 17:46, , 24F
我自己習慣沒有在輕拍，都用tip吸沖(看個人手法)
12/28 17:46, 24F
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12/28 17:52, , 25F
以24的flask養，1mL的trypsin就無法覆蓋，均勻潤一下
12/28 17:52, 25F
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12/28 17:53, , 26F
放到培養箱30秒~1分鐘，拿出來輕拍或沖吸都可
12/28 17:53, 26F
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12/28 18:58, , 27F
以我來說100mm dish(area 55cm2)約0.7ml, 60mmdish(21cm2)
12/28 18:58, 27F
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12/28 18:59, , 28F
約0.3ml,因此T25(25cm2)對我來說用1ml綽綽有餘了
12/28 18:59, 28F
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12/28 19:01, , 29F
不過就算T25用1ml,我還是無法理解沖吸後再把trypsin吸掉的
12/28 19:01, 29F
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12/28 19:01, , 30F
理由 (還是其實不是吸掉,只是去除泡泡?)
12/28 19:01, 30F
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12/28 19:30, , 31F
以0.05%的trypsin來說，10cm dish加0.3-0.4ml, 6cm dish
12/28 19:30, 31F
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12/28 19:30, , 32F
加0.2-0.3ml, 放常溫一分鐘可用沖吸將我們家的癌細胞
12/28 19:30, 32F
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12/28 19:31, , 33F
打下來，但normal cell line則會在trypsin覆蓋後，將多
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12/28 19:31, , 34F
餘的trypsin吸掉，培養箱反應，加如medium沖吸打下，這
12/28 19:31, 34F
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12/28 19:31, , 35F
樣的方式對於我們家的正常細胞傷害比較小。
12/28 19:31, 35F
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