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[求救] PCR突然做不出來

看板Biotech (生命科學)作者 (Lord of Ethanol)時間9年前 (2016/01/18 21:18), 9年前編輯推噓2(2推 0噓 29→)
留言31則, 9人參與, 最新討論串1/1
各位大大好 首po有不對的地方見諒 小弟之前有爬文看過pcr時有時無那篇 但好像沒有找到答案 小弟的pcr條件: 模板vector大小5.7kbp ，其中900多bp是我想放大的片段 primer F 長度26bp Tm70.6 GC73.1% primer R 長度53bp Tm67.5 GC41.5% 模板濃度 0.5ng/ul primer濃度 兩個都是0.25uM PCR溫度 95度5分鐘 95度30秒, 60度30秒, 65度6分鐘 循環35次 65度7分鐘延長 最早之前在extension溫度68度 都做不出來 後來改成extension 65度的條件就p的出來 重點是 我大概2~3個月前換成extension 65度p出來之後，怎麼p都不會失敗 中間兩個月沒做pcr之後到現在，有一些原因要再回頭p，用一樣的條件怎麼p都是沒有任 何產物，就在電泳膠的最底下糊糊一小片而已 kit是用一模一樣的，而且新開的跟舊的都做不出來 模板vector DNA重新搖菌再抽過，新舊vector都p不出來 primer stock濃度100uM 溶劑為一般DDW，冰-20 有可能是primer當初沒有使用滅菌水配stock solution嗎 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.139.11.140 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1453123103.A.C67.html
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01/18 22:20, , 1F
建議你加一下3-5%DMSO
01/18 22:20, 1F
小弟不是專業的，想問DMSO在這邊的作用是?
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01/18 22:39, , 2F
plasmid templateㄟ,以為隨便加就有了
01/18 22:39, 2F
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01/18 22:42, , 3F
一般來說extension 68度沒東西不是要提高溫度嗎,怎是降低?
01/18 22:42, 3F
但真的做得出來的時候，草率的加一樣都會出來，做了十幾次都沒失敗， 跟老師討論後是猜測68度超過我們primer的Tm值導致primer還沒來得及做就脫落了， 但結果似乎證實我們的假設正確，改低之後成功做出
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01/18 22:47, , 4F
..嗯... 先來管新的primer 再跑一次gradient就知道了?
01/18 22:47, 4F
這實驗快放棄了XD可能不會買新primer
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01/19 01:27, , 5F
應該有Vecter上既有的primer可以當control吧？覺得是你引子
01/19 01:27, 5F
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01/19 01:28, , 6F
出差錯了。
01/19 01:28, 6F
會嘗試這個trouble shooting，謝謝! ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/19/2016 15:42:36
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01/19 16:19, , 7F
因為你的引子長度差太多，就在這周，學弟也是類似的問題
01/19 16:19, 7F
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01/19 16:21, , 8F
一樣是以plasmid當template，兩primer一長一短，低溫時產物
01/19 16:21, 8F
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01/19 16:23, , 9F
長度不對，高溫時，全部都是primer dimer
01/19 16:23, 9F
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01/19 16:25, , 10F
第三次就加3%DMSO+gradient，結果任何溫度都有出來
01/19 16:25, 10F
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01/19 16:28, , 11F
因此你的問題，我認為是長的那一條沒有解開所致，至於DMSO
01/19 16:28, 11F
這邊小弟不太懂,不是95度就幾乎完全展開,然後降溫之後互補的primer黏上,接著升溫開始延長 整個過程是在哪一個環節上,使較長的primer容易脫落之後能改善PCR結果呢?
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01/19 16:29, , 12F
你可以查詢dmso VS pcr，若實驗室有閒錢，也可用BETAINE
01/19 16:29, 12F
推
01/19 16:32, , 13F
dmso會降低 Tm值 ，但會增加非專一辨識
01/19 16:32, 13F
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01/19 23:01, , 14F
那通常PCR extension都在72度，primer怎麼不會掉?
01/19 23:01, 14F
小弟有點算跨領域實驗吧,很多細節都無法參透,但確實在降低extension溫度之後成功做出, 而且是可以重複的,似乎我們這個假設是正確的? 能在72度工作的primer是否Tm值或者GC%較高呢?
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01/19 23:02, , 15F
為什麼你65度要6分鐘...這是哪支polymerase..我想認識
01/19 23:02, 15F
推
01/20 02:30, , 16F
900bp要做6分鐘真的超久orz
01/20 02:30, 16F
protocol給的標準溫度是68度,所以我們認為65度會降低反應速率,會需要更長的時間, 因為我們目的也只是要能重複做出來就好了,就先不改條件了,所以這個時間是沒有最佳化過的
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01/20 13:28, , 17F
可能誤以vector大小5.7kbp計算extension的時間吧？
01/20 13:28, 17F
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01/20 14:35, , 18F
可能是因為65不是polymerase最佳作用溫度所以才要那麼
01/20 14:35, 18F
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01/20 14:35, , 19F
久？
01/20 14:35, 19F
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 17:04:08 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 17:05:05
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01/20 17:41, , 20F
95是解開了，但回來72or68時，primer自黏比黏template高時
01/20 17:41, 20F
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01/20 17:43, , 21F
就會沒0.9k只會有一兩百b.p.的primer dimer，因此若是你發
01/20 17:43, 21F
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01/20 17:44, , 22F
現主產物是一兩百的話，建議你加DMSO，annealing tem.直接
01/20 17:44, 22F
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01/20 17:46, , 23F
72，elongation一分鐘即可，我建議你做看看，不到一小時半
01/20 17:46, 23F
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01/20 17:46, , 24F
就可確定
01/20 17:46, 24F
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01/20 17:47, , 25F
但我發現你短primer只有26，你有確定可黏上的部分有超過18?
01/20 17:47, 25F
了解了謝謝你,短primer的26個是完全互補,長primer則有30個完全互補 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:06:59 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:10:45
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01/20 18:17, , 26F
整個實驗條件修改的方式不合理
01/20 18:17, 26F
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01/20 18:18, , 27F
既然長primer只有30配對,Tm一定會更低,應該先降60而非68度
01/20 18:18, 27F
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01/20 18:19, , 28F
除了anneal可調整,一般extention設定在68~72其實不會動
01/20 18:19, 28F
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01/20 18:21, , 29F
會動extention主要是希望降低速度減少突變,而非增加anneal
01/20 18:21, 29F
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01/20 18:25, , 30F
除非實驗有特殊目的,不然應該捨棄現有條件,依照通用protoc
01/20 18:25, 30F
有想過primer可能黏不上,之前annealing溫度從40~65都試過,記得是都沒有產物所以去改 extension溫度看看,只是當時改條件之後突然一直都做得出來了,所以一直認為假設正確, 但實際情形可能要靠各位大大指教 ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:36:53
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01/20 18:32, , 31F
你們是以plasmid當template,Tm低一點也不用擔心雜band
01/20 18:32, 31F
了解!謝謝大家的意見,目前實驗結果是加了1%DMSO馬上就出現產物,但並不是非常專一, 我的目標大小是主要產物,但有較少量的雜band以及smear的情形,我會再調整條件看看 所以我之前的情形應該如IMR大大所說,傾向於primer自黏 ※ 編輯: s992003 (36.237.23.151), 01/23/2016 14:20:30
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