[求救] PCR達人請教一段怎麼p都p不出來的區域

看板Biotech (生命科學)作者sylvialalala (sylvia)時間9年前 (2016/01/28 10:44)推噓5(5推 0噓 22→)

留言27則, 6人參與討論串1/1

想請教ＰＣＲ達人有關一段怎麼Ｐ都Ｐ不出來的genome區域(昆蟲) 我之前從沒遇過這樣的問題....已經不知道如何解了圖示primer設計 A_F B_F B_R A_R B這段區域約300 bp 是可以成功的有問題的是A這個區域約1500 bp 怎麼p都p不出來（前後已經設計10對primer 交叉互p也都不行）只有一對有微弱的band 但是不是每個sample都有試過的條件： TM: primer tm約50~52 每個溫度都有試過 (目前頃向再跑gradient) mgcl2 2mM （雖然也可以跑gradient 但因為連band都沒有我覺得應該無效）雖然gc約只有33% 但有試過final 1mM betaine 無效 A_F/B_R 或是B_F/A_R 也失敗 (這裏的A有大概五對primer在試) 請教達人我還可以怎麼試呢？有增加dna template到2ul 但還是沒改善 (有用positive確認過dna ok) 謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 72.89.115.239 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1453949096.A.DB7.html

推

micocat

01/28 12:36, , 1^F

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目前是用invitrogen的amplitaq 也有換過master mix or kapa的taq 還是無法p → hitmd: 用哪一支polymerase? invitrogen的amplitaq 01/28 13:07

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xxtomnyxx

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已試過betaine 或是dmso跟betaine作用不一樣？

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xxtomnyxx

01/28 13:38, , 3^F

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有試過各種annealing了但denature的溫度與時間不同會有幫助？

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xxtomnyxx

01/28 13:40, , 4^F

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有試過1, 2ul 但似乎dna越多p的band越明顯一點

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xxtomnyxx

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xxtomnyxx

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這就要另外買了.....

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xxtomnyxx

01/28 13:41, , 7^F

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確認是正確的

推

jabari

01/28 15:33, , 8^F

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Ice9

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Ice9

01/28 22:07, , 10^F

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Ice9

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兩三段接合也是無法p (aF/bR bF/aR p不出) 不是鑑種是要看mutation有無成功 degenerate primer??可以麻煩說詳細一點嗎？今天try增加到80 cycle (40+40) 還有annealing 跑gradient試試 ※ 編輯: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:09:07 ※ 編輯: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:10:14

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Ice9

01/30 20:09, , 15^F

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Ice9

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Ice9

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