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[求救] 搖菌後抽plasmid

看板Biotech (生命科學)作者 (Ling)時間9年前 (2016/08/03 23:22), 9年前編輯推噓11(11推 0噓 25→)
留言36則, 11人參與, 最新討論串1/1
不知道各位有沒有碰過像我一樣的狀況 之前有碰過盤子有長但菌搖不起來，LB是沒問題的（可是明明就是用同一支抗生素，是因 為長一個colony比長一管容易？） 然後最近又碰到盤子長了，菌也搖起來了，但抽出來質體濃度和260/230都很低…… 想知道這種現象代表什麼意思呢(>﹏<)? By 做cloning做到崩潰的研究生 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.248.119.192 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1470237770.A.8DA.html
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08/03 23:26, , 1F
SA汙染
08/03 23:26, 1F
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08/03 23:26, , 2F
長的菌可能不是你原本的 E.colii
08/03 23:26, 2F
剛好汙染的菌抗抗生素這樣嗎@@?
推
08/03 23:37, , 3F
之前遇到LB長不好時，嘗試過兩種做法：1.改用其他種的培養液
08/03 23:37, 3F
→
08/03 23:39, , 4F
2.先養在比一般培養時更少量的LB裡，養起來後再transfer到較
08/03 23:39, 4F
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08/03 23:40, , 5F
大量的LB繼續養。此外，盤子較容易接觸到空氣，LB若沒有搖晃
08/03 23:40, 5F
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08/03 23:42, , 6F
就不易接觸空氣，或者搖晃程度剛好不適合菌生長，都可能影響
08/03 23:42, 6F
嗯嗯！ 我有試過先搖小體積的方法，最近我們會移到共儀那邊搖，看會不會是我們培養 箱轉速或空氣流動的問題
推
08/04 00:21, , 7F
你搖菌的體積跟瓶子的大小各是? 看起來是生長得不好
08/04 00:21, 7F
12cc養菌管，試過搖8cc和5cc
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08/04 00:25, , 8F
你完全沒提到這是一般的菌(plasmid)或有什麼特殊的部分
08/04 00:25, 8F
不好意思沒說清楚，這是我做cloning把我ligation的成品拿去transformation的菌～是 一般的DH5a ※ 編輯: a102740826 (111.248.119.192), 08/04/2016 01:25:44
推
08/04 01:47, , 9F
濃度低的話也可能是菌長不夠 如果不是transformation
08/04 01:47, 9F
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08/04 01:47, , 10F
有問題 或許是菌加太少
08/04 01:47, 10F
推
08/04 01:50, , 11F
12cc看起來是抽mini? 那菌液加多少？
08/04 01:50, 11F
Protocol上建議1.5-7.0mL 我加7mL
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08/04 07:27, , 12F
12cc的管超過3cc就太多了
08/04 07:27, 12F
真的嗎@@!!?? 那我下次可以改用錐形瓶搖
推
08/04 10:04, , 13F
檢查抗生素有沒有問題，上個月大家都發生這樣的狀況，
08/04 10:04, 13F
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08/04 10:04, , 14F
結果發現kantamycin跟ampicillin標反了
08/04 10:04, 14F
我們也有懷疑過抗生素放太久，所以前陣子買了一罐新的。（話說標反也太…… 老闆知 道應該會暴走XD?） ※ 編輯: a102740826 (140.112.59.208), 08/04/2016 16:52:42
推
08/04 23:37, , 15F
檢查你的盤子是否放太久 是否平時放4度C? 有時侯是抗生
08/04 23:37, 15F
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08/04 23:37, , 16F
素失效，你挑的都是雜菌。另外我通常早上十點前就挑clone
08/04 23:37, 16F
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08/04 23:37, , 17F
放入5ml去搖37C 250rpm, 下午六點就不少了。5ml絕對不是
08/04 23:37, 17F
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08/04 23:37, , 18F
問題。如果還是抓不出原因，全部重配一次。同時借別人的
08/04 23:37, 18F
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08/04 23:37, , 19F
抗生素來一起試試，兩間實驗室同時發生問題的機率低。
08/04 23:37, 19F
推
08/05 01:04, , 20F
12ml tube頂多2CC吧 至少留3X~4X體積的空氣給菌生活
08/05 01:04, 20F
推
08/05 01:45, , 21F
我覺得搖菌不是問題耶 我5ml LB加5ml 菌一樣搖的起來
08/05 01:45, 21F
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08/05 01:50, , 22F
別亂教,搖菌基本原則只能用1/3-1/5的體積,加滿是不對的
08/05 01:50, 22F
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08/05 01:53, , 23F
原po還是沒說用哪一類的plasmid,一般mini-prep效率是1ml
08/05 01:53, 23F
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08/05 01:56, , 24F
可取得5-10ug了,扣掉暫留份,搖超過3ml完全不符合效益
08/05 01:56, 24F
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08/05 02:08, , 25F
這類似問題的可能性有1.抗生素失效,像溫度過高就已先加
08/05 02:08, 25F
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08/05 02:11, , 26F
照光太久分解或plate久置失效等,致plate與搖菌的生長差異
08/05 02:11, 26F
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08/05 02:16, , 27F
另外不熟悉無法區份satellite也算是
08/05 02:16, 27F
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08/05 02:17, , 28F
2.越來越多特殊plasmid是不穩定,會自行重組,也會長不起來
08/05 02:17, 28F
推
08/05 07:41, , 29F
抱歉打錯 是5ml LB+5ul的菌QQ
08/05 07:41, 29F
推
08/05 14:12, , 30F
資訊要寫詳細點大家才能找問題啊~用什麼菌、搖多久
08/05 14:12, 30F
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08/05 14:13, , 31F
抗生素濃度多少、copy number、用甚麼方法抽等等XD
08/05 14:13, 31F
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08/05 14:15, , 32F
話說260/230比值問題應該只是抽的方法的問題吧
08/05 14:15, 32F
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08/05 14:15, , 33F
所以plasmid濃度太低搞不好也只是方法問題
08/05 14:15, 33F
推
08/06 01:39, , 34F
盤子很可能污染，重配先
08/06 01:39, 34F
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08/07 00:41, , 35F
12ml養8ml，搖起來不會灑出來嗎？而且一般都斜放吔？管子裡
08/07 00:41, 35F
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08/07 00:42, , 36F
面，就像B大說的，超過1/3就要考慮分管了。
08/07 00:42, 36F
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