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[求救] transfection 細胞變少

看板Biotech (生命科學)作者 (pig)時間9年前 (2016/08/12 15:19), 9年前編輯推噓4(4推 0噓 22→)
留言26則, 9人參與, 最新討論串1/1
大家好 我最近在用Panc1這株細胞做轉染的實驗 轉染試劑是用lipofectamine 2000 (2uL/well)(24well的條件) DNA總量為3.5ug/well 細胞取80000顆種入24孔盤 在20-24小時的時候開始轉染 在加入了Lipofectamine/plasmid complex 培養4-6小時之後 更換成新鮮培養基 這個時候我在吸除含轉染試劑的培養基時候 就發現 常常會有細胞被我吸起來而變少的情況 有時會有很明顯的一大片消失(之前其它細胞HepG2, CHO-K1也是) 我記得lipo本身就是有毒性的 所以細胞或多或少變脆弱被吸走也是正常 問了我的同事們有沒有也會這樣 他們說還好 沒有很明顯 於是我想知道到底我這情況是不是正常 或是能做什麼改善？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 203.71.94.19 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1470986356.A.57F.html
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08/12 15:37, , 1F
我覺得lipo2000在24well用2ul是非常多(毒)的,有調整空間
08/12 15:37, 1F
我是照著它在24well的最低建議量來試的 不知道blence大 建議可以下修到多少？
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08/12 16:31, , 2F
現在毒性小很多的試劑價錢也不差.不用一定堅持lipo2000
08/12 16:31, 2F
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08/12 18:07, , 3F
用3000這些升級版的 應該可以減少毒性
08/12 18:07, 3F
沒辦法~實驗室還剩很多lipo2000 ※ 編輯: a14743535 (36.226.246.166), 08/12/2016 22:09:47
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08/12 22:27, , 4F
細胞太滿嗎？所以整片被吸起來了
08/12 22:27, 4F
推
08/12 22:36, , 5F
咦新版跟舊版差好多… 我24well才下0.8ug DNA+2ul lip
08/12 22:36, 5F
2uL lipo2000 大大不是跟我用的一樣嗎？ 但我DNA總量為3.5ug/well
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08/12 22:36, , 6F
o ; 但通常我 lipo會砍半或再砍半(即2.5)用
08/12 22:36, 6F
是0.5手誤成2.5嗎？
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08/12 22:36, , 7F
前一天細胞養在哪裡啊
08/12 22:36, 7F
就直接種在24well裡，培養20~24小時；開始進行轉染 ※ 編輯: a14743535 (36.226.246.166), 08/12/2016 23:10:44
推
08/13 00:34, , 8F
實驗室剩很多沒辦法買3000的話 2000的可以促銷給我們>
08/13 00:34, 8F
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08/13 00:34, , 9F
<
08/13 00:34, 9F
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08/13 00:36, , 10F
在24well要用到3.5ug,那lipo用2ul也不夠阿
08/13 00:36, 10F
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08/13 00:38, , 11F
要先降低DNA用量,如果已知是plasmid或RNAi效率問題
08/13 00:38, 11F
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08/13 00:40, , 12F
應該跟本去換backbone,而不是忍受超多的DNA用量
08/13 00:40, 12F
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08/13 10:06, , 13F
我之前6-well一個well送4 ug DNA,LF2000 加10ul
08/13 10:06, 13F
推
08/13 12:21, , 14F
是0.5ul sorry; 新版的 DNA建議量都有點太高,找一下舊
08/13 12:21, 14F
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08/13 12:21, , 15F
版的
08/13 12:21, 15F
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08/14 00:24, , 16F
DNA 太多, lipo用2, DNA用1差不多.
08/14 00:24, 16F
前幾天老師要我把plasmid都直接拿去跑電泳~ 確認一下是不是都還是處於非linear的樣子 如果不是linear 那是不是single band 到這裡我就有個問題 plasmid 不是有circular form及supercoiled form 難道這兩者不會同時出現嗎？ 然後我看我的電泳圖 看起來plasmid都有一些變成linear form但量不多 這是我抽plasmid的技術不好嗎？ ※ 編輯: a14743535 (203.71.94.31), 08/15/2016 13:34:50
推
08/19 02:09, , 17F
如果你的plasmid是直接抽完作transfection，當然理論上
08/19 02:09, 17F
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08/19 02:10, , 18F
plasmid是circular，又會因機率出現supercoiled form
08/19 02:10, 18F
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08/19 02:12, , 19F
所以你在膠上當然不會看到linear，除非你有用限制酶切
08/19 02:12, 19F
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08/19 02:13, , 20F
另外想看linear和circular最好用TAE bfr.，不知是否用這
08/19 02:13, 20F
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08/19 02:14, , 21F
回歸回來，如果所有的試劑,培養液和細胞都跟別人一樣
08/19 02:14, 21F
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08/19 02:15, , 22F
但實驗做出來你的就是有問題，那就請人看你操作是否沒問
08/19 02:15, 22F
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08/19 02:15, , 23F
題，反之如果材料不一樣，可能有汙染之虞，請更換再試
08/19 02:15, 23F
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10/16 09:36, , 24F
消失整片的狀況，我有遇過，只是主要在換optiDMEM過程
10/16 09:36, 24F
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10/16 09:36, , 25F
中觀察到，實際原因還不太明確，可以嘗試medium沿壁面緩
10/16 09:36, 25F
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10/16 09:36, , 26F
慢加入
10/16 09:36, 26F
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