[求救] western blot 重下不同二抗

看板Biotech (生命科學)作者 (Lord of Ethanol)時間9年前 (2016/08/29 07:50), 編輯推噓1(108)
留言9則, 6人參與, 最新討論串1/1
各位大大早安,手機發文抱歉 小弟想問的是 小弟用anti his-tag的抗體偵測sf9細胞株 沒有進行蛋白質定量,大約使用90% T75的細胞數 使用BCIP+NBT呈色 有加長呈色時間,但是完全沒有band出現 但是聽說正常來說細胞做anti his-tag呈色都會有東西跑出來(學長姐之前做也是說會有 一些些雜band) 猜測二抗本身有些問題 原因是二抗上次用到剩下約3ul 感覺還可以做個幾次 但沒想到下次做實驗就乾了 小弟拿去稍微離心結果跑出大概30ul... 可能都是水了!? 想問說我這片膜還可以洗ㄧ洗再下一次新的二抗嗎 因為如果照理論的話我的樣品蛋白跟一抗還卡在膜上 不知道有沒有大大這樣做過 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.13.114.135 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1472428230.A.835.html

08/29 08:25, , 1F
可以 只是算是偷懶方法(有次懶得stripping 直接下成功過)
08/29 08:25, 1F

08/29 12:52, , 2F
可以啊,不過eppendorf從冰箱取出本來就要稍微spin down啊…
08/29 12:52, 2F

08/29 13:06, , 3F
Stripping也不用很久阿 大概10-15分鐘 再用TBST洗一下就
08/29 13:06, 3F

08/29 13:06, , 4F
可以重新上抗體了
08/29 13:06, 4F

08/29 14:05, , 5F
直接上就好 第一次沒訊號表示根本沒抗體黏上去
08/29 14:05, 5F

08/30 22:13, , 6F
題外話,"正常來說細胞做anti his-tag呈色都會有東西跑出來"
08/30 22:13, 6F

08/30 22:16, , 7F
不是有特定表現His-tag protein的情況才可能會偵測到band嗎?
08/30 22:16, 7F

08/30 22:18, , 8F
所以一般細胞株偵測不到band應該才是正常的吧? @@?
08/30 22:18, 8F

09/09 15:26, , 9F
可以二抗直接上,stripping後從blocking開始也行
09/09 15:26, 9F
文章代碼(AID): #1NmtZ6Wr (Biotech)
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