[求救] 用Oligo dT跟一Forward primer取代3' RACE
大大們好：
想請問有人有用過oligo dT跟Sequence裡的forward primer去跑PCR
夾出用oligo dT轉出的cDNA(RNA有poly A tail)嗎
會這麼做是有點想避開3' RACE，而且實驗室有人有成功過(雖然是不同的RNA)
不知道有沒有經驗可以分享一下
我之前做常會遇到well很亮，但沒有band的情形
用了hot start
步驟大概是：
PCR mixture (GeneDirex HiFi系列) without polymerase 95度C 4 min後迅速放回冰上
再把polymerase加進去，然後on一般的program (initial denature, denature...)
結果well卡章的情形有好轉，目標band也慢慢出來了，只是亮度都很淡而且有雜band
所以就提高了annealing temperature(55-->60)，雜band有減少，但目標band還是不亮
因為實驗需要定序RNA的全長，這個片段需要被Clone出來
希望PCR product的量能多一點
不知道有沒有人有甚麼方法可以幫忙改善這個情形
或類似經驗可以分享的，謝謝！
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※ 編輯: kaofei (140.112.96.149), 09/04/2016 17:17:54
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