[求救] DNase去活

看板Biotech (生命科學)作者kaofei (phoebe)時間9年前 (2016/09/30 22:29)推噓2(2推 0噓 4→)

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大家好，又來問問題了...這次是跟轉RT去除genomic DNA污染有關就是我想要amplify 一段 (+) ssRNA病毒的sequence 方法是用Qiamp viral RNA kit抽cell lysate的viral genome 然後用Roche的first-stranded cDNA synthesis kit轉RT 之後用paper發表的序列(不是配對好的F跟R，因為我想要夾的片段較大)跑PCR 我的目標產物約5400 bp，這對primers是可以夾出來，但是量都很少(35 cycles) 而且在1600的地方會有超亮(大概Target band 10x以上)的雜band，well也很亮試過調整Ta後沒甚麼效果，想說genomic DNA汙染是個問題，把它去掉再跑看看但因為手邊沒有DNase，我想到實驗室還有另一個quantitech for qPCR的轉RT kit 裡面有個東西叫gDNA wipe out buffer...也許可以拿來用用我就姑且一試按protocol 12的RNA(對...我沒測濃度沒有稀釋)加2的gDNA wipe out 42度2分鐘後置於冰上然後我就直接轉到Roche的protocol Briefly就是 11的RNA(剛剛的mixture)加2的sequence-specific primer 65度C，10分鐘後置於冰上然後加入7的RT的mixture 先室溫10分鐘，然後50度1小時，最後85度5分鐘去活化，放冰上接著跑PCR 結果1600的Band完全沒了，但我的target band也沒了... 剩well很亮然後smear下來所以我想請問 1. gDNA wipe out buffer裡應該是有DNase吧 2. 我的結果有可能是因為DNase把我的cDNA或RNA或Primer亂水解所造成的嗎我查資料說DNase去活可以用加熱或是EDTA 可是我並沒有在開始合成我的cDNA或跑PCR以前做任意兩者之一來去活DNase (Quantitech的protocol中也沒有特意加熱去活的步驟，但我不確定是否之後的buffer有特別的Formula可以完成這件事) 但好像PCR一開始Denaturer 90幾度可以發回同樣的功能阿... 所以我比較擔心還是在合成cDNA這部分。不知道有沒有人有經驗可以分享，當然如果不行我就會重新找專一性更高的primer來try了謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.149 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1475245786.A.C8C.html ※ 編輯: kaofei (140.112.96.149), 09/30/2016 22:30:17 ※ 編輯: kaofei (140.112.96.149), 09/30/2016 22:31:04 ※ 編輯: kaofei (140.112.96.149), 09/30/2016 22:32:12