[求救] Aβ peptide western blot
在下最近在做有關阿茲海默症的研究
需要以 Western blot 去看Aβ(β-amyloid, 4.5kDa) 及其聚合物在 model 中的表現量
此 model 經 ELISA 以及 IHC 偵測後確認有 Aβ 的表現
但以 western blot 去壓，則是完全無法看到 band
以下是 protocol
Gel: 15% tris-tricine gel
Runnung buffer:
Cathode (1L):Tris-base 12.1g
Tricine 17.9g
SDS 1g
pH 8.8
Anode (1L): 0.2M Tris-base pH 8.8
跑完膠後以160mA/1hr (以調整過時間，再減少會轉不上membrane)
以全濕式轉漬 transfer 至 0.22μm PVDF
Transfer buffer (1L):
Tris-base 3g
Glycine 14.4g
MeOH 200 ml
Transfer 後以5%脫脂奶粉 blocking
後以 6E10 antibody 1:1000 hybrid overnight
以TBST wash 20 min/3 times
再以2抗 1:5000 hybrid 1hr
後 TBST wash 20 min/3 times
接著ECL顯影，結果均看不到12kDa以下的band 如圖http://imgur.com/tc89Lpj
也有切開hybrid過亦看不到訊號，目前推測是在樣品前處理 (RIPA buffer)中未加PMSF
請問這過程有什麼需要注意的問題嗎?
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