[求救] 請問關於plasmid construction注意事項

看板Biotech (生命科學)作者smallmin (小明)時間8年前 (2016/11/03 20:05)推噓0(0推 0噓 25→)

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小弟我不算分生新手該知道的基本操作步驟都知道碩士期間開始接觸plasmid construct 剛開始做初期成功率也有60% 後來當了三年多助理 construct plasmid成了一個很基本的技術挑的clone成功率90%以上很正常幾乎沒有重做三次內做不出來的construct 我這一年多來換工作後 construct非常不順利連TA cloning成功率也很低常見的狀況是 transform隔天single colony很多常常破百可是用restriction enzyme切大小總是不符預期重做5次挑了50個colony 90%的pattern都一樣切出來pattern可以再現但都不對 ex: 我預期切出來是3.1 kb + 1.0 kb 可是切出來90%都是3.5 kb + 0.6 kb 甚至發生總大小比預期大的狀況 ex: 預期plasmid最後是7.3 kb 卻看到7.0 kb + 1.5 kb 定序結果都不對或者enzyme切出來不對 colony PCR結果 90%的clone band卻正確可是定序一樣不對因為我不是新手碩士畢業又有三年多實驗室助理經驗這種基本實驗卻一直失敗過去一年來construct成功率只有一成左右可是我同事們都很順利很少發生重做三次內沒成功的狀況讓我壓力很大我跟主管同事請教過試過很多方法 https://www.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/troubleshooting-guide-for-cloning 這類troubleshooting的資料也看不少譬如ligation 加PEG3350 (final concentration 7.5%) 用commercial competent cell, RecA1 (抑制DNA recombination) http://download.rbcbioscience.com/HIT%20Competent%20Cells/Competent%20Cells/HIT-21/HIT-DM.pdf 我是用HIT-DH5alpha 一年過去了還是沒什麼改善進度緩慢壓力很大歸納常見狀況 1. 轉型順利 single colony很多常破百但enzyme切出來結果不對 2. 我用只有insert上才有 vector沒有的切位 enzyme可以切出band 推測insert有接進去但大小不對想請教各位是否可以給我什麼建議提醒我其他該注意的細節謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 203.70.89.22 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1478174756.A.B75.html

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