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[求救] WB壓片很糊

看板Biotech (生命科學)作者 (kiwivivi)時間8年前 (2016/12/10 02:33), 8年前編輯推噓11(11推 0噓 29→)
留言40則, 9人參與, 最新討論串1/1
請問大家 這週我做WB的時候跑SDS都很順利，Maker都很清楚。 可是tranfer完後小分子maker就糊掉了。 壓片後70kDa以上也都糊了，但是actin卻還可以，請問這是那個環節出問題? http://i.imgur.com/C93sjZY.jpg
http://i.imgur.com/hyp3pLl.jpg
跑的條件 12%gel 65v 15min 115v 到10kDa到底 pvdf膜先泡甲醇活化 黑色) 一片海綿一片吸水紙 膠 膜 吸水紙 海綿 轉的是400mA 80分鐘 800ml tranfer buffer+200ml methanol 拜託各位大大了!!!! ----- Sent from JPTT on my Asus ASUS_T00P. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.139.235.223 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1481308383.A.D73.html
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12/10 09:33, , 1F
附圖沒marker看不懂
12/10 09:33, 1F
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12/10 09:37, , 2F
每個size都有最適合的gel%,如果%過低,actin也是會糊掉的
12/10 09:37, 2F
上圖是actin 43的 下圖是parp 89/116
推
12/10 13:06, , 3F
咦你只有一片吸水紙？ 不是兩片嗎
12/10 13:06, 3F
我這次只放一片，比較薄，之前用原場的比較厚所以都用一片。
推
12/10 15:14, , 4F
70kd可以跑10%，比較美
12/10 15:14, 4F
謝謝^^本來要同時壓17的 所以用12% 是否有點太貪心XD
推
12/10 22:42, , 5F
看不太懂問題 是指小分子跟70kDa以上都糊 只有actin(42左
12/10 22:42, 5F
沒錯沒錯，就是這樣。
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12/10 22:42, , 6F
右)是正常的 這樣嗎?
12/10 22:42, 6F
推
12/11 01:07, , 7F
給你參考~60v跑1hr 100v跑2.5hr 注意保冷 小分子跑比較久
12/11 01:07, 7F
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12/11 01:07, , 8F
過熱膠會溶掉 transfer 180ma 80分鐘
12/11 01:07, 8F
感謝! 跑膠的條件試試看，可是有個小疑問180ma ?? ※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:37:41 ※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:38:43 ※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:40:15 ※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:41:42 ※ 編輯: virusgg (223.138.64.86), 12/11/2016 08:42:59
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12/11 09:37, , 9F
如果會過熱溶膠請檢查一下buffer,因為比原po更長的條件我
12/11 09:37, 9F
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12/11 09:43, , 10F
們都在用,另外"小分子跑比較久",這應該是寫錯了
12/11 09:43, 10F
推
12/11 11:09, , 11F
作膠時下膠底部有時會有很小氣泡 仔細看才看得出來膠有點
12/11 11:09, 11F
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12/11 11:09, , 12F
波浪狀 所以跑到太底部的話小分子蛋白就會歪七扭八的 然
12/11 11:09, 12F
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12/11 11:09, , 13F
後12%同時看你要的大中小分子是ok的 猜測是否transfer時
12/11 11:09, 13F
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12/11 11:09, , 14F
膠融了? actin 看起來ok只是因為它量多......只是猜測
12/11 11:09, 14F
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12/11 11:09, , 15F
給你參考
12/11 11:09, 15F
推
12/11 15:51, , 16F
12%膠應該沒問題 我可以從17壓到120
12/11 15:51, 16F
推
12/13 12:21, , 17F
可能是Transfer時溫度太高
12/13 12:21, 17F
推
12/13 16:14, , 18F
看起來可能是1抗體專一性問題2定量未準確3蛋白質可能表現
12/13 16:14, 18F
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12/13 16:17, , 19F
量有問題 若有興趣可以寫信biotip@outlook.com 可再分析
12/13 16:17, 19F
推
12/13 20:15, , 20F
transfer時我不會調那麼高~會低於180mA
12/13 20:15, 20F
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12/14 12:09, , 21F
發現溫度偏高就會開始糊，在跑SDSPAGE的時候，就發現make
12/14 12:09, 21F
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12/14 12:09, , 22F
r糊了，60v 20min 110v 95min。
12/14 12:09, 22F
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12/14 12:09, , 23F
12/14 12:09, 23F
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12/14 12:26, , 24F
大家若遇到壓出來，有的很乾淨有的很髒，明明操作都同時
12/14 12:26, 24F
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12/14 12:26, , 25F
，且髒的還沒有要的band會先
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12/14 12:26, , 26F
1.一抗比例調高
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12/14 12:26, , 27F
2.wash時間加長為一小時，10分鐘換一次
12/14 12:26, 27F
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12/14 12:26, , 28F
3.換抗體
12/14 12:26, 28F
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12/14 12:26, , 29F
4.先去大吃一頓再說...==
12/14 12:26, 29F
推
12/14 18:19, , 30F
跑膠就溫度太高 請確認你的running buffer及膠配方 有沒
12/14 18:19, 30F
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12/14 18:19, , 31F
有錯 這電壓條件跑膠應該ok
12/14 18:19, 31F
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12/14 19:11, , 32F
running buffer是買的，不會錯吧==
12/14 19:11, 32F
推
12/14 20:16, , 33F
稀釋倍數錯誤也是有可能發生的呀~~
12/14 20:16, 33F
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12/15 03:07, , 34F
同意樓上, 10倍稀釋有時變成9倍, 11倍稀釋之類QQ
12/15 03:07, 34F
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12/15 11:38, , 35F
自行google會看到running buffer真的有兩種,主要差異在
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12/15 11:38, , 36F
glycine,分別是192mM與250mM
12/15 11:38, 36F
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12/21 23:38, , 37F
謝謝大家，那天要稀釋20x running buffer時特別觀察一下
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12/21 23:38, , 38F
，竟然發現放在下層4℃冰箱中的buffer 結冰了== ，結了
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12/21 23:38, , 39F
一層冰，看建議儲存是4℃~25℃，我還放蠻底下的冰箱門邊
12/21 23:38, 39F
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12/21 23:38, , 40F
。所以果然是稀釋倍率問題。
12/21 23:38, 40F
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