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[求救] 搖菌抽plasmid (large insert)

看板Biotech (生命科學)作者 (phoebe)時間8年前 (2017/03/17 11:52), 8年前編輯推噓3(3推 0噓 34→)
留言37則, 6人參與, 最新討論串1/1
各位大大好 想請教一個狀況 我做5'RACE，用kit內附的in-fusion cloning kit塞了一個快8kb的insert進到pRACE vector內 vector本人約2.6 kb 之後transform到 Top10 competent cell然後塗盤、挑菌 2.5 ml LB+amp 搖overnight後限制酶切割有release出預期大小的片段 但plasmid 濃度很低，大概20-40 ng/ul吧 (picodrop感覺不太準) 會低於生技公司定序濃度的下限 於是我取35 ul的15% glycerol stock加入7.5 ml的LB+amp 在50 ml離心管中搖o/n 結果長超多，但汙染了...因為抽出來濃度還是很低 想請問 對於這種large insert長很慢的狀況 要收集到一定濃度的plasmid，放大volume去增菌的想法應該沒錯吧？ 如此汙染的狀況會比較容易發生嗎？ 我在思考哪個程序污染的時候，想到glycerol好像沒有無菌... 因為LB是新泡的，也是放涼後才加amp，自認應該沒有問題 那想請問如果Glycerol要變無菌，常用的方法有哪些？ 好像不建議autoclave，但過filter感覺會天荒地老... 想說有沒有比較便捷的方式>< 謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.149 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1489722721.A.854.html
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03/17 12:09, , 1F
應該是混到雜菌 建議re-transform重新塗盤挑single colony
03/17 12:09, 1F
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03/17 12:10, , 2F
再放大, 還有50% glycerol(glycerol+H2O)autoclave沒問題
03/17 12:10, 2F
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03/17 12:25, , 3F
樓上的意思是，不是因為我insert太大所以長比較差?
03/17 12:25, 3F
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03/17 12:26, , 4F
因為我最初挑single colony的時候，只要是陽性的就長很慢
03/17 12:26, 4F
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03/17 12:27, , 5F
喔我懂你的意思了XD~~謝謝
03/17 12:27, 5F
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03/17 12:28, , 6F
但我想請問，如果是50% glycerol用來做stock要多少比例啊?
03/17 12:28, 6F
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03/17 13:27, , 7F
我是1:1加啦! final 25%
03/17 13:27, 7F
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03/17 13:28, , 8F
不過我是用含50% glycerol的LB
03/17 13:28, 8F
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03/17 16:15, , 9F
可否再請問large insert轉型的效率降低，是因為影響到菌
03/17 16:15, 9F
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03/17 16:15, , 10F
的生長(菌量低)，還是因為她從high-copy變成low-copy?
03/17 16:15, 10F
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03/17 16:16, , 11F
我一直以為是前者，因為搖菌(o/n)後總是相對清澈，但後者
03/17 16:16, 11F
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03/17 16:17, , 12F
是否也有可能？如果是low-copy的plasmid，搖出來菌量多但
03/17 16:17, 12F
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03/17 16:19, , 13F
plasmid少是正常的嗎？因為之後也有可能用BAC就好奇問問~
03/17 16:19, 13F
推
03/17 18:16, , 14F
可能啊 是說凍菌final 10%應該就夠了
03/17 18:16, 14F
推
03/17 18:17, , 15F
一般從stock拿菌建議摳摳塗盤 再挑single colony 你沒
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03/17 18:17, , 16F
有把stock解凍吧?
03/17 18:17, 16F
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03/17 18:30, , 17F
有耶~但我當初凍了兩管stock XD stock解凍不宜超過幾次嗎?
03/17 18:30, 17F
※ 編輯: kaofei (140.112.4.208), 03/17/2017 18:32:27
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03/17 22:28, , 18F
一次都嫌太多...
03/17 22:28, 18F
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03/17 22:52, , 19F
copy number跟大小比較沒關 跟plasmid的ori有關
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03/18 08:58, , 20F
所以如果plasmid用完了，通常寧可拿plasmid重新轉型?而非
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03/18 08:59, , 21F
取Stock直接增菌嗎？還是挑stock的菌不需要解凍?沾一下塗?
03/18 08:59, 21F
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03/18 09:37, , 22F
還沒定序,不知道要不要保存的plasmid,為什麼要凍stock?
03/18 09:37, 22F
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03/18 09:42, , 23F
怕太晚凍會汙染...想說Glycerol便宜..真定序錯了在丟掉
03/18 09:42, 23F
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03/18 09:45, , 24F
而且沒做過這麼大的insert...怕錯過任何陽性的colony XD"
03/18 09:45, 24F
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03/18 19:08, , 25F
不用解凍 拿tip摳一點在plate上亂畫就好
03/18 19:08, 25F
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03/18 22:39, , 26F
我都挖一點丟 LB搖 (掩面
03/18 22:39, 26F
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03/19 00:21, , 27F
還在plasmid check階段就每管mini凍菌不是更會汙染出錯嗎
03/19 00:21, 27F
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03/20 20:16, , 28F
好像沒發生過這樣的問題所以沒有考慮過，只是俊放在4度C到
03/20 20:16, 28F
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03/20 20:17, , 29F
到定序確認(一般要兩天時間吧)不擔心菌死掉或雜菌汙染嗎?
03/20 20:17, 29F
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03/20 21:35, , 30F
養的時候有加抗生素啦，另外菌沒脆弱到放個兩天就掛掉啦
03/20 21:35, 30F
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03/22 15:43, , 31F
那那可以借問個問題嗎？如果Toxic insert想要在RT長，搖菌
03/22 15:43, 31F
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03/22 15:45, , 32F
一般12-16小時，若RT或30度會搖多久？中途會要補抗生素嗎
03/22 15:45, 32F
推
03/22 17:29, , 33F
amp比較麻煩因為他的resistance gene會吐到胞外, 所以
03/22 17:29, 33F
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03/22 17:30, , 34F
我會建議starter culture如果養37要換medium再拉OD跟i
03/22 17:30, 34F
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03/22 17:30, , 35F
nduction. 低溫一點還有其他的antibiotics應該沒這個
03/22 17:30, 35F
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03/22 17:30, , 36F
問題, 搖多久跟用多少iptg還請自己嘗試XD
03/22 17:30, 36F
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03/22 17:50, , 37F
上面好像回錯了,應該是講下一篇的
03/22 17:50, 37F
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