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[求救] 大腸桿菌表達問題

看板Biotech (生命科學)作者 (Lord of Ethanol)時間8年前 (2017/05/01 18:11), 8年前編輯推噓2(2推 0噓 11→)
留言13則, 4人參與, 最新討論串1/1
哈囉各位大大 小弟在做重組蛋白的表達 最近因為業務的推薦 把表達的菌株從原先的BL21換成C43（DE3) plyss 第一步送vector到菌裡面塗盤沒問題 第二步要從盤上篩選較強的菌這邊有些疑問 學長姐傳下來的做法是挑幾個較大的菌株 都把他們搖16小時然後破菌 不用離心分掉膜跟細胞質 直接western看表現量 選Band深的就對了 請問這樣的做法是正確的嗎？ 上網查有聽說要測什麼copy number但不知道要怎麼測量 另外想問要怎麼確認我的蛋白產生inclusion body 這個蛋白是周邊膜蛋白，但paper推測的穿膜區域已經把他切掉了 之前用BL21表達 測試好幾種detergent 還有不同濃度的條件 都沒辦法溶出很多蛋白 也沒有能做活性測試的材料 所以不知道有沒有產生inclusion body -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 117.19.146.85 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493633464.A.76B.html
推
05/01 20:40, , 1F
copy number從你用的plasmid去追查就知道了吧
05/01 20:40, 1F
原來copy number完全是跟基因有關 跟後面的事情無關!? 會不會我這個蛋白試了各種條件都沒起色就是因為用了濫vector QQ
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05/01 21:00, , 2F
TM拿掉應該就是有機會soluble了吧，為啥還用C43？
05/01 21:00, 2F
我們本來都這樣子想，但跑膠結果看起來還是一堆卡在膜上的樣子，不知道如何是好 ※ 編輯: s992003 (123.205.17.239), 05/01/2017 21:46:07
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05/02 01:07, , 3F
copy number跟plasmid的ori有關
05/02 01:07, 3F
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05/02 01:08, , 4F
你要做活性還要收inclusion body? refolding比擲杯還
05/02 01:08, 4F
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05/02 01:08, , 5F
難啊
05/02 01:08, 5F
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05/02 05:35, , 6F
聽起來是本來想要透過測活性來看有沒有 inclusion body
05/02 05:35, 6F
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05/02 05:36, , 7F
但是沒有測活性的 assay 所以想要用其他方式判斷是否產生
05/02 05:36, 7F
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05/02 05:36, , 8F
inclusion body?
05/02 05:36, 8F
我不想要inclusion body，但是不知道有沒有發生inclusion body i大沒錯，我的想法是聽說inclusion body的蛋白通常不會具有活性，想看活性來判斷 現在跑膠來看感覺蛋白卡死在膜上，用detergent溶出的效果極差，但不確定是否產生inclusion body 我以為C43 plyss會有比較好的結果，比BL21貴兩倍說QQ ※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 05/02/2017 09:09:23
推
05/02 13:44, , 9F
測表達條件我會離心分 supernatant 跟 pellet 然後跑膠看
05/02 13:44, 9F
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05/02 13:46, , 10F
看 induction 有沒有成功 並看是不是 soluble
05/02 13:46, 10F
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05/02 13:47, , 11F
（不過很久沒表達/純化蛋白了，有錯請大家指正>< ）
05/02 13:47, 11F
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05/02 20:18, , 12F
如果有閒錢的話 買一點bugbuster 看soluble/ib非常方
05/02 20:18, 12F
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05/02 20:18, , 13F
便 而且small scale可以用很久
05/02 20:18, 13F
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