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[求救] 蛋白純化解凍後出現沉澱

看板Biotech (生命科學)作者 (migu0531)時間8年前 (2017/05/01 22:14), 編輯推噓12(12推 0噓 31→)
留言43則, 8人參與, 最新討論串1/1
最近遇到蛋白的問題……做了好多批都這樣 蛋白是用昆蟲細胞表現的，經過I-per破細胞（有加PMSF）、離心後，用Ni -column純化 elute buffer= 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0 蛋白純化完放4度 2、3天沒有看到沉澱。原本是想說測完蛋白濃度後，再加甘油放-20度 保存。但遇到六日又怕蛋白降解，所以直接放-20度 禮拜一冰上解凍後，出現白色沉澱，用Bio rad protein dye測蛋白濃度可以看到藍色顆 粒物（應該是我的蛋白……） 請問改怎麼辦？（之前別的蛋白有做過濃縮與PBS置換，直接凍-20就沒這樣。) 為什麼會沉澱？後續要做elisa 篩血清，沉澱物應該不能用 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.42.53.162 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493648067.A.057.html
推
05/01 22:21, , 1F
多試幾種不同的buff啊......
05/01 22:21, 1F
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05/01 22:31, , 2F
前一個elution buffer是用20mM sodium phosphate, 0.5M
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05/01 22:31, , 3F
NaCl, 500mM imidazole,pH 7.4 ，也是會沉澱
05/01 22:31, 3F
推
05/01 22:34, , 4F
沈澱物經過vortex後會溶解嗎？之前遇過會再溶回去的
05/01 22:34, 4F
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05/01 22:37, , 5F
沉澱物用PBS溶不了……我的蛋白啊啊
05/01 22:37, 5F
推
05/01 22:43, , 6F
那你只好純化完馬上置換buffer了...(默）
05/01 22:43, 6F
推
05/01 22:46, , 7F
是不是有些蛋白不適合冷凍，我有買過蛋白然後建議不要冷
05/01 22:46, 7F
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05/01 22:46, , 8F
凍的，比冷藏還容易壞
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05/01 23:09, , 9F
蛋白不建議冷凍我就不清楚了！ 只知道不建議反覆凍溶。
05/01 23:09, 9F
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05/01 23:09, , 10F
蛋白真是條不歸路……
05/01 23:09, 10F
推
05/02 00:21, , 11F
高濃度imidazole最好不要冷凍，立刻置換buffer比較理想
05/02 00:21, 11F
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05/02 01:56, , 12F
做protein就不要期待週末可以放假了...
05/02 01:56, 12F
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05/02 01:57, , 13F
column elute下來就透析吧
05/02 01:57, 13F
推
05/02 05:15, , 14F
推 Invec 高 imidazole 不要凍... 而且一般凍會作 flash
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05/02 05:16, , 15F
freezing 吧? 你說直接放 -20C 有經過 flash freezing 嗎?
05/02 05:16, 15F
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05/02 07:17, , 16F
Flash freezing?應該沒有……蛋白就直接從4度丟到-20，
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什麼也沒做也沒加東西
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05/02 07:21, , 18F
想問問大家，都用什麼方法置換buffer? 目前我有用過amic
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05/02 07:21, , 19F
on離心加buffer順便濃縮。還有AKTA的desalting column，
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05/02 07:21, , 20F
但蛋白就被大量稀釋，連western都認不到，根本不知道再
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05/02 07:21, , 21F
哪個fraction出來……
05/02 07:21, 21F
推
05/02 07:36, , 22F
Amicon/dialysis/ultrafiltration/desalting column
05/02 07:36, 22F
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05/02 07:37, , 23F
Akta desalting column 連 280 吸收都看不到嗎？之前也有
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05/02 07:38, , 24F
用過 pd-10 這種 open column 還算省事
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05/02 08:24, , 25F
有一個很小很小的peak，但跑膠跟western一片空白
05/02 08:24, 25F
推
05/02 09:18, , 26F
那應該是你的protein沉澱卡在column裡面了...
05/02 09:18, 26F
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05/02 09:19, , 27F
desalting column了不起稀釋濃度2-5倍而已 WB不會看不到
05/02 09:19, 27F
推
05/02 13:29, , 28F
是第一次純化的蛋白？目標 buffer 是有文獻參考或繼承別人
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05/02 13:30, , 29F
的 protocol?
05/02 13:30, 29F
推
05/02 13:34, , 30F
全新 protein 可能 buffer condition 要多試試 (這是在假
05/02 13:34, 30F
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05/02 13:35, , 31F
設你表達的條件/nickel column 純化條件都沒問題的狀況下)
05/02 13:35, 31F
推
05/02 13:37, , 32F
另外關於溫度, 確實有些蛋白在室溫可能還比4度/-20度穩定
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05/02 13:38, , 33F
這就要自己試; 回到凍的方式, 一般我是都丟液氮 flash
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05/02 13:39, , 34F
freezing, 避免 cold denaturation
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05/02 13:39, , 35F
然後存 -80
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05/02 20:30, , 36F
接別人的蛋白，但留下的資料不多，只知道之前的人是用ak
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05/02 20:30, , 37F
ta pure純化，我也照做，但還是沉澱。
05/02 20:30, 37F
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05/02 20:38, , 38F
另外很奇怪的事,我有配一瓶10倍的binding buffer 放4度
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05/02 20:38, , 39F
幾天就出現片狀的結晶沉澱…… 不知道使用的二次水有無
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05/02 20:38, , 40F
問題?
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05/02 22:14, , 41F
10x buffer 低溫可能鹽析出而已
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推
05/05 08:48, , 42F
低溫乾燥離心機可以濃縮代換buffer的樣本 ，但若有其他鹽
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→
05/05 08:48, , 43F
類存在也會一起被濃縮
05/05 08:48, 43F
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