[討論] protein保存在7M UREA還容易裂解嗎?

看板Biotech (生命科學)作者 (NEET)時間8年前 (2017/05/27 15:50), 編輯推噓5(5020)
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我最近在分析ECM,先用guanidin萃取,因為要跑SDS-PAGE,所以還有透析 凍乾再用tris+UREA 7M回溶放-20°C。 因為跑膠發現趨勢不太對,所以重新BCA定量,雖然每次3重複定量的準度很高,但 不同次定量卻會有差異。 我的問題是,這個差距是怎麼造成的? 有猜過proteinase inhibitor作祟,因為從透析開始就沒有inhibitor了。但 反過來說,ECM應該也不好切吧?每次trypsin過後盤子上還是一堆。 -- 最近你的吸引力將大幅上漲,周遭的異性將慢慢的被你迷惑,慢慢的開始愛上你......。 唯一美中不足的是───────那群異性中有一半以上是齧齒目,其餘的則是爬蟲類。 或是你也可以換個樂觀的角度───愛上你的只有不到一半是爬蟲類,其餘都是齧齒目。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.137.77 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1495871403.A.2F7.html

05/27 17:51, , 1F
重複解凍嗎? 還是同一批分裝?
05/27 17:51, 1F

05/27 18:35, , 2F
重複解凍
05/27 18:35, 2F

05/28 14:09, , 3F
那有可能是重複解凍造成的蛋白質裂解,其實Urea放在
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05/28 14:09, , 4F
4度就很穩定了,蛋白質樣本要放在-20或-80還是分裝
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05/28 14:09, , 5F
比較安全
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05/28 14:10, , 6F
Urea回溶的sample放一般冰箱能存多久我不知道,我有
05/28 14:10, 6F

05/28 14:11, , 7F
一隻樣本放了半年跑膠看起來沒甚麼差別
05/28 14:11, 7F

05/30 15:37, , 8F
請問為何重複解凍會傷害protein?
05/30 15:37, 8F

05/30 15:37, , 9F
所以用UREA不需要擔心protease的影響嗎?
05/30 15:37, 9F

05/31 00:20, , 10F
結凍會使某些蛋白易斷裂 (?)而失活
05/31 00:20, 10F

05/31 01:35, , 11F
用guanidine萃的時候不加inhibitor應該也沒關係
05/31 01:35, 11F

05/31 01:35, , 12F
蛋白質在urea或guanidine的狀態都是denature的
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05/31 01:36, , 13F
protease會直接失活,所以不會有太大影響
05/31 01:36, 13F

05/31 01:39, , 14F
denature時重複解凍的降解就是鍵結斷裂,詳細不明XD
05/31 01:39, 14F

06/01 20:25, , 15F
凍乾後保存要用時在回溶比較好吧 在liquid 內凍時氫鍵
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06/01 20:25, , 16F
有時會破壞蛋白
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06/05 10:17, , 17F
了解!不過透析成純水要凍乾這一段,不曉得protease會不會
06/05 10:17, 17F

06/05 10:18, , 18F
作怪。但又不可能把整個燒杯灌滿inhibitor....
06/05 10:18, 18F

06/05 22:45, , 19F
有確認過BCA kit能夠compatible的urea濃度嗎?
06/05 22:45, 19F

06/06 09:30, , 20F
BCA寫3M,坦白說我不曉得3M是5X稀釋前還是稀釋後...
06/06 09:30, 20F

06/07 18:16, , 21F
記得是稀釋後; 透析體積多大啊
06/07 18:16, 21F

06/07 18:22, , 22F
是說我老闆不太建議抽乾凍蛋白,會有抽乾不易回溶或 d
06/07 18:22, 22F

06/07 18:22, , 23F
egrade問題; 有考慮收細胞時,直接分裝好幾管相同濃
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度的,用一次就丟?
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06/07 18:34, , 25F
沒看到 guandine抽…請省略抽乾那段 Xd
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文章代碼(AID): #1PAI-hBt (Biotech)
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