[求救] 電轉後細胞會aggregate
大家好：
想請問電轉mammalian cell的問題。
我的細胞是vero，電轉的核酸是~30k的RNA
protocol大致如下：
細胞會前一天繼代到175T，實驗當天約8-9分滿
Trypsin 2ml下去後等約五分鐘，細胞都變圓變亮後輕敲detach
medium回溶後4度離心，去除上清液
PBS wash兩遍後細胞計數，並回溶到適當濃度 (1x10^7/ml)
將RNA加入細胞(0.8 ml)後加入0.4 cm的cuvette
參數是4 pulses at 450V, 50uF
細胞hood內recover 10 min，transfer到已回溫complete growth medium
隔天觀察細胞
我的問題是，電轉完後我的PBS-cell suspension都會有很多泡泡，這是正常的
但細胞常常會aggregate在一起，變得跟鼻涕一樣濃稠
然後似乎aggregate越多，代表細胞viability越差，會貼下去的細胞越少
但我不太確定這可能是哪個步驟所造成的。
是細胞本人(新解凍約第5代)？
Detachment過程 (trpsin下去後rinse幾遍就會倒掉然後等細胞rounding)?
電轉的buffer?
因為實驗需求，貼下去的細胞之後還要再碰trypsin，所以要有一定的滿度，不然就GG了
不知道有沒有人有經驗可以分享的，有那些小細節我可能沒注意到造成細胞存活下降
還有要怎麼避免細胞Aggregate的問題
大感謝>"<
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