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[閒聊] 如果Poly A tail沒有以A作結

看板Biotech (生命科學)作者 (phoebe)時間8年前 (2017/09/18 21:01), 編輯推噓6(6推 0噓 31→)
留言37則, 10人參與, 最新討論串1/1
想請問 就如果以人為的方式轉出mRNA，通常會在3'端幫他做個poly A tail 假使當初把gene clone進plasmid，但沒有設計好限制酶切位 早成產物切下來後還會帶有一段限制酶切位在poly A tail之後 如下方 T7-ATGXXXXXX.........TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTACC 這會影響到mRNA的功能嗎？ 謝謝~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.149 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1505739670.A.73A.html
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09/18 21:10, , 1F
才疏學淺.....第一次看到人工加poly a
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09/18 21:11, , 2F
如果要表現成protein，只要你的cds完整就可以了
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09/18 21:12, , 3F
轉譯做到stop codon就會停了不是嗎
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09/18 23:06, , 4F
用primer induce poly A不行嗎@@？我看paper是這樣弄得...
09/18 23:06, 4F
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09/18 23:10, , 5F
我印象中poly A是用來保護mRNA的，但不確定會不會影響轉譯
09/18 23:10, 5F
推
09/19 00:38, , 6F
我也是第一次看到自己加polyA的...
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09/19 02:26, , 7F
看你的mRNA想幹嘛啊
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09/19 07:58, , 8F
你看過plasmid map 嗎？在MCS後面通常會有poly-A signal，不
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09/19 08:00, , 9F
需要人工加上A尾。而且，你加上去，它也是被當作3'UTR一部分
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會黏上什麼東西，不知道。
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09/19 09:06, , 11F
想用來做transient expression of the targed protein
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推
09/19 11:06, , 12F
這是好問題 可以研究看看
09/19 11:06, 12F
推
09/19 11:38, , 13F
要不要先check你的plasmid有沒有polyA阿 通常都有耶
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09/19 13:10, , 14F
如果原po用T7來表現,是沒有polyA的,我剛看pRSET,pET45就是
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09/19 13:16, , 15F
就算是一般vector用的SV40 polyA,也不會是全都A
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09/19 13:46, , 16F
原PO的T7感覺是in vitro transcription時用的
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09/19 13:47, , 17F
接進去的plasmid不知道是哪個promoter
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09/19 13:48, , 18F
不過已經做過in vitro transcription了，從那個plasmid
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09/19 13:49, , 19F
切下來接到要用的expression plasmid就好啦
09/19 13:49, 19F
推
09/19 20:13, , 20F
他要ivt出rna再電進細胞啦 如果是這樣我覺得那幾個bas
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e會有差
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09/19 21:36, , 22F
抱歉，眼殘沒見到T7在前。
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09/20 12:37, , 23F
想請問樓樓上會有差是因為甚麼呢? 3'UTR太長或序列錯嗎 ><
09/20 12:37, 23F
推
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我覺得電進去後的stability會很糟
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推
09/22 20:01, , 25F
同上沒看到T7, 是我就會重做, 不希望有這種不確定因素
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09/22 20:02, , 26F
避免因此使後面troubleshooting疑神疑鬼的
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09/23 08:35, , 27F
忽然想到，因為mRNA是裸露的，所以後面多幾個其他bases可能
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09/23 08:36, , 28F
沒有差別，進去要不是做幾個蛋白出來，就是馬上被消滅。重點
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09/23 08:37, , 29F
可能還是在RNA品質等其他因素上。另外，記得以前看過 poly-G
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09/23 08:38, , 30F
在細菌有較長的half-life，但不知道在細胞株中是否也是。
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09/24 04:25, , 31F
樓上，mRNA可不是裸露的阿.... polyA tail 就是讓 PABP
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09/24 04:26, , 32F
黏上去，以減緩 RNase 從 3' 端快速降解掉 mRNA
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09/24 18:40, , 33F
它送進去就是裸的啊。送進細胞去，就看是PABP先靠上去還是
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09/24 18:41, , 34F
exonuclease先解決它。
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09/24 22:16, , 35F
謝謝大家提供的意見XD 我看到paper上polyA後面會接的RE
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09/24 22:16, , 36F
切位包括BamHI跟NotI，前者會留一個T，後者留GC，看來是可
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09/24 22:17, , 37F
行的，但我自己的會多4個bp，所以就很好奇這影響會有多大
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