[求救] Western Blot做出來的band會歪向一邊
各位Western Blot 大大好
目前在做Sucrose gradient 跑超高速離心的實驗
想了解細胞膜上蛋白在lipid raft上的位置
以下實驗步驟參考論文所述
細胞收自100mm dish
加入850ul Sodium Carbonate刮下所有細胞也一併加入蛋白酶抑制劑了
將850ul混合90%Sucros再依續疊上不同濃度的Sucrose
上機離心overnight後共收了10個layer
各別加入Sample buffer 98度煮10分鐘
接下來進入WB步驟
10% gel
Running condition: 80V 30min後再120V 100min
Transfer condition: 400mA 2hr(只剩marker上面一點點殘留在膠上其他的都過去了)
Blocking: 3% skim milk 1hr
1st Ab: Santa Cruz Ab 1:100 overnight 4度
Wash 三次共60min
2nd Ab: HRP 1hr at RT
Wash
呈色用Thermo家出的Femto呈色
結果出現band往左移的現象，而且也不夠Sharp
想請問各位高手是否有方法可以改善
重覆很多次都要崩潰了
附上圖連結https://imgur.com/Dj9w6p6
感謝大家
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 60.248.185.187
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1505901069.A.8ED.html
推
09/21 00:38, , 1F
09/21 00:38, 1F
→
09/21 00:38, , 2F
09/21 00:38, 2F
推
09/21 00:40, , 3F
09/21 00:40, 3F
→
09/21 09:17, , 4F
09/21 09:17, 4F
→
09/21 09:19, , 5F
09/21 09:19, 5F
→
09/21 09:19, , 6F
09/21 09:19, 6F
推
09/21 10:09, , 7F
09/21 10:09, 7F
推
09/21 17:47, , 8F
09/21 17:47, 8F
推
09/21 20:57, , 9F
09/21 20:57, 9F
→
09/22 15:08, , 10F
09/22 15:08, 10F
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
97
171