PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[求救] 關於Luciferase轉染到Fibroblasts疑問

看板Biotech (生命科學)作者 (云云)時間7年前 (2018/01/10 06:58), 編輯推噓1(1推 0噓 38→)
留言39則, 6人參與, 7年前最新討論串1/1
最近實驗進行到將克隆在pGL3 basic裡的DNA片段用Luciferase測試表現程度。 目前測試條件為：24孔板，每孔400ng DNA，1ul Lipo2000，有使用pGL4.74為對照，每孔濃度0.1ng， 在60%細胞滿盤時轉染，中間不換液，等待36小時裂解後讀盤。 (我做的事之前實驗室助理教我的，但是我有在網上查到轉染時建議用沒有血清也沒有抗生素的培養液， 而且六小時後換含血清不含抗生素的培養液，不知道是否適合我的情況？) 老師希望我使用Lipofectamine 2000轉染這些Plasmid到Fibroblasts，實驗結果，最高的數字大約是六百多。 但數據老師不太滿意，告訴我"the efficiency is not enough"。 想請問大家，如何的efficiency才是達到標準... 不知道這是不是一個很基礎的問題，但因為是半路轉行所以有一些基礎知識不懂，查了文獻之後心中仍然感到疑惑沒有找到答案， 希望有經驗的大大能幫忙回答或是指點一下方向，感謝 -- Sent from my Windows -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 198.184.147.19 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1515538693.A.173.html
→
01/10 07:06, 7年前 , 1F
600多是對照組的值嗎？
01/10 07:06, 1F
→
01/10 07:08, 7年前 , 2F
有很多地方需要檢驗，像是質體的品質，細胞本身好不好
01/10 07:08, 2F
→
01/10 07:08, 7年前 , 3F
轉殖
01/10 07:08, 3F
→
01/10 07:09, 7年前 , 4F
如果材料跟步驟都是前人留下的又沒人能討論會比較難找
01/10 07:09, 4F
→
01/10 07:09, 7年前 , 5F
原因
01/10 07:09, 5F
→
01/10 07:10, 7年前 , 6F
抱歉因為網路問題好像多送出一段推文
01/10 07:10, 6F
→
01/10 07:13, 7年前 , 7F
600~1000左右是實驗組的值，對照renilla大約是100出
01/10 07:13, 7F
→
01/10 07:13, 7年前 , 8F
頭
01/10 07:13, 8F
→
01/10 07:15, 7年前 , 9F
老師有說過這種細胞轉染效率本來就不好，但是我很疑
01/10 07:15, 9F
→
01/10 07:15, 7年前 , 10F
惑的是，那怎麼樣的數據才是能夠接受的
01/10 07:15, 10F
→
01/10 08:35, 7年前 , 11F
用相對值，不要用絕對值
01/10 08:35, 11F
→
01/10 14:02, 7年前 , 12F
Renilla 太低了，這樣很危險。
01/10 14:02, 12F
→
01/10 14:04, 7年前 , 13F
你測測看一組只放 ffLuc 和一組只放 rLuc 去測，你
01/10 14:04, 13F
→
01/10 14:04, 7年前 , 14F
Renilla 讀值 100 出頭以 Luciferase assay 來說太接近
01/10 14:04, 14F
→
01/10 14:05, 7年前 , 15F
background 了。然後如果是質疑你 transfection 效率，
01/10 14:05, 15F
→
01/10 14:06, 7年前 , 16F
你就做一次 transfect 表現 EGFP 的 vector，看有 EGFP
01/10 14:06, 16F
→
01/10 14:07, 7年前 , 17F
表現的細胞有多少，在和前人或網路上同細胞株的實驗對
01/10 14:07, 17F
→
01/10 14:07, 7年前 , 18F
照，就可以知道是你轉染不好還是該段 DNA 本身的
01/10 14:07, 18F
→
01/10 14:07, 7年前 , 19F
transcriptional activity 很差了。
01/10 14:07, 19F
→
01/10 14:09, 7年前 , 20F
另外，用無血清培養基 transfection 的問題，我個人用
01/10 14:09, 20F
→
01/10 14:09, 7年前 , 21F
lipo2000 和 lipo3000 都做過測試，至少在我用的細胞株
01/10 14:09, 21F
→
01/10 14:10, 7年前 , 22F
上幾乎沒有影響，不過這可能取決於培養基種類和細胞種
01/10 14:10, 22F
→
01/10 14:11, 7年前 , 23F
類，比起問人得到含糊不清的答案，自己測試看看才是最
01/10 14:11, 23F
→
01/10 14:11, 7年前 , 24F
有效的解決辦法
01/10 14:11, 24F
推
01/10 16:40, 7年前 , 25F
我們是至少混DNA時要無血清，有些資訊甚至會連抗生
01/10 16:40, 25F
→
01/10 16:40, 7年前 , 26F
素都不建議添加，真的要試過才會知道。總之先分析
01/10 16:40, 26F
→
01/10 16:40, 7年前 , 27F
一下做相同細胞的paper選用的條件，然後再用GFP測
01/10 16:40, 27F
→
01/10 16:40, 7年前 , 28F
試轉染效率，最好連liposome跟DNA的比例都titrate
01/10 16:40, 28F
→
01/10 16:40, 7年前 , 29F
一下比較好，不同細胞在做luc的時候讀值也不同，我
01/10 16:40, 29F
→
01/10 16:40, 7年前 , 30F
們老師至少要求到千位，然後相對量比絕對量重要，
01/10 16:40, 30F
→
01/10 16:40, 7年前 , 31F
給你參考一下。
01/10 16:40, 31F
→
01/10 20:25, 7年前 , 32F
"600~1000左右是實驗組的值，對照renilla大約是100出頭"
01/10 20:25, 32F
→
01/10 20:25, 7年前 , 33F
原po推文這句話,不像是co-transfect操作的描述方式
01/10 20:25, 33F
→
01/10 20:25, 7年前 , 34F
也不知道100是指純pGL4.74的值,還是pGL3/pGL4.74的相對值
01/10 20:25, 34F
→
01/11 12:17, 7年前 , 35F
補充說明一下，我每孔是加0.1ng的pGL4.47以及400ng
01/11 12:17, 35F
→
01/11 12:17, 7年前 , 36F
的DNA
01/11 12:17, 36F
→
01/11 12:22, 7年前 , 37F
感謝大家意見，明天馬上先選一組DNA測試看看1ng per
01/11 12:22, 37F
→
01/11 12:22, 7年前 , 38F
well renilla 在ffLuc/rLuc還有血清與抗生素移除與
01/11 12:22, 38F
→
01/11 12:22, 7年前 , 39F
否的差別。
01/11 12:22, 39F
‣ 更多 belle0625070 的文章
文章代碼(AID): #1QLKa55p (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 belle0625070 的文章
文章代碼(AID): #1QLKa55p (Biotech)