[求救] 切膠純化後DNA再次跑膠卡在well中

看板Biotech (生命科學)作者patricksky (江伯)時間7年前 (2018/01/18 16:41)推噓1(1推 0噓 6→)

留言7則, 4人參與討論串1/1

各位好, 最近發現PCR產物(200bp多)切膠後，再次跑膠發現產物不見了，並且似乎卡在 gel well上，有smearing DNA痕跡 https://i.imgur.com/aFQ96yL.jpg

但是positvie control DNA 同樣切膠純化後，DNA產物再次跑膠是沒問題。實驗做了三次，後兩次純化步驟有換新buffer，但是三次產物切膠後都不見了，產物似乎都卡在gel well裡面，但是positvie control三次實驗同樣沒問題。檢體PCR產物量比control少，產物亮度介於100和500bp亮度中間，不算多也不算少，同時檢體有很多其他bands，control是一條band 檢體是病人血液 DNA，positive control是健康人血液 DNA 因為positive control沒問題，所以我認為PCR和切膠純化步驟本身沒有問題，是否是檢體本身造成的影響? 以下是其他資訊 1. 使用Bioman EasyPure PCR Clean up/Gel extraction Kit 2. 因有人共用此產品，buffer 會分管使用，有換過新分管buffer 3. 依據使用說明書，純化步驟有改兩個地方，我用2% Gel，所以binding buffer多一倍很久之前有發現DNA會不純，所以wash buffer再多洗一次 4. Elution step 用過ddH2O和 Elution buffer，狀況都一樣，擔心是汙染造成DNA degradation，所以 ddH2O和Elution buffer都有換過。另外擔心可能DNA殘留在column上，有多通一次Elution step，結果第二管去跑膠和 nanodrop 檢測都沒有DNA。 5. DNA 有可能自己亂組合，有95度C 煮10分鐘後自然冷卻，但是沒有改善。 6. 考慮到個人實驗操作的影響，有請另一人幫忙單獨做一次，結果還是一樣慘。而且positive control 沒問題。 7. 這實驗在上禮拜做其他病人檢體沒問題，有拿上禮拜不同病人的舊檢體再做一次，舊檢體沒問題。還有可能是哪邊出問題? PCR結果雖然不是單一產物，但是畢竟主要的產物還在，控制組也沒問題，所以PCR有問題的嫌疑很小。總覺得還是純化kit嫌疑最大，但是控制組和舊檢體又可以做成功。最後要回歸到這次檢體本身身上? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.136.109.82 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1516264918.A.023.html

推

joseph103331

01/18 22:32, 7年前 , 1^F

01/18 22:32, 1^F

感謝提醒,我跑看看過column後的DNA是否還在

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blence

01/18 23:04, 7年前 , 2^F

01/18 23:04, 2^F

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blence

01/18 23:04, 7年前 , 3^F