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[求救] western blot壓出空白片

看板Biotech (生命科學)作者 (sunny)時間7年前 (2018/01/20 23:53), 編輯推噓6(6推 0噓 21→)
留言27則, 11人參與, 7年前最新討論串1/1
我最近在做western blot 我大學到研究所期間都做過western blot 都有做出結果 現在到其他實驗室做WB卻做不出來 實驗室的人幾乎都做過WB 只是不是在這間實驗室做的 是在其他實驗室做的 所以東西藥品是舊的 細胞蛋白抽取後測完濃度冰到-80 然後加6X sample buffer煮5分鐘 loading到10% SDS PAGE上膠80V 下膠120V marker有分開 transfer buffer 是用tris和glycine也有加20% methanol和0.4% SDS transfer用biorad 的tank 條件是300mA 1.5hr 轉到NC membrane上 marker每條都有轉過去 然後因為之前第一次做的時候也是都空白片 所以這次有用ponceus S染膜 卻沒染出任何東西 我們沒有染膠 因為沒有comasin blue 然後就5% milk blocking 一抗目標抗體1:1000 overnight 二抗anti-mouse 1:5000 暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片5分鐘 底片超乾淨 沒東西 strip後 blocking 1hr 1Ab anti-bactin 1:5000 overnight 4度C 2ab anti-mouse 1:5000 1hr RT TBST wash 三次 十分鐘後 暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片10分鐘 底片很乾淨沒東西 想問這是什麼問題? 還有因為我以前都是用PVDF膜 但這裡是用NC的 我的transfer條件是用以前的方式 想問NC的transfer 條件是? 就是關於時間和安培的部分 謝謝 我真的做到快崩潰 希望大家解救阿 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.132.101.105 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1516463615.A.21E.html
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01/21 01:35, 7年前 , 1F
奶粉是好的嗎
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01/21 01:50, 7年前 , 2F
NC用法很不一樣...
01/21 01:50, 2F
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01/21 08:24, 7年前 , 3F
我跟你的方法幾乎完全一樣
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01/21 08:24, 7年前 , 4F
換成PVDF就好了
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01/21 08:33, 7年前 , 5F
網路上的相關討論指出，可能是ECL過期。https://goo.gl/D
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01/21 08:33, 7年前 , 6F
Q18Nv
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推
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我目前的lab也是NC membrane做不出來，雖然我自己覺得這
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01/21 08:35, 7年前 , 9F
東西沒有過期的問題，但由於我同樣的做法換成PVDF就做出
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01/21 08:35, 7年前 , 10F
來了，實在讓我不得不懷疑NC
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01/21 08:58, 7年前 , 11F
ponceus S沒染到東西，會不會是定量或稀釋的問題
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01/21 13:35, 7年前 , 12F
我是這篇的原PO,因為我的帳號暫時不能回,我先借別人的回
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01/21 13:36, 7年前 , 13F
M大 我的牛奶是新買的,應該是沒問題.E大想請問NC用法不同,
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01/21 13:37, 7年前 , 14F
是指哪方面不同?那他transfer的條件是?
01/21 13:37, 14F
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01/21 13:38, 7年前 , 15F
A大 我們目前可能不太能換成PVDF阿
01/21 13:38, 15F
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01/21 13:39, 7年前 , 16F
想請問為何ponceus S沒染到會是蛋白稀釋和測濃度的問題?
01/21 13:39, 16F
推
01/21 16:46, 7年前 , 17F
NC有點脆弱不太能strip,ponceus S沒染到東西很怪
01/21 16:46, 17F
推
01/21 22:41, 7年前 , 18F
好奇如果你現在待的實驗室是用NC片，有參考先前的操作方
01/21 22:41, 18F
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01/21 22:42, 7年前 , 19F
法嗎？如果沒有，你寫的步驟從何處參考？不過除了這些，
01/21 22:42, 19F
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01/21 22:43, 7年前 , 20F
用Ponceus S染膠沒染出東西問題更大，應該是前處理樣本
01/21 22:43, 20F
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01/21 22:43, 7年前 , 21F
就有問題。
01/21 22:43, 21F
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01/22 07:46, 7年前 , 22F
如果你人在台北，我借你PVDF跟comassie blue做troublesho
01/22 07:46, 22F
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01/22 07:46, 7年前 , 23F
oting如何？有需要請私
01/22 07:46, 23F
推
01/22 16:14, 7年前 , 24F
gel 上有東西嘛？
01/22 16:14, 24F
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01/22 17:16, 7年前 , 25F
NC有看到marker,ponceus S沒染到band,先去關心有無蛋白
01/22 17:16, 25F
推
01/23 03:18, 7年前 , 26F
我實驗室用GE NC膜, transfer 300mA 2 hr
01/23 03:18, 26F
推
03/03 13:37, 7年前 , 27F
Transfer 時取消 0.4% SDS 試試
03/03 13:37, 27F
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