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[求救] NEB stable competent E.coli

看板Biotech (生命科學)作者 (TATA box)時間7年前 (2018/02/11 22:54), 7年前編輯推噓5(5推 0噓 23→)
留言28則, 4人參與, 7年前最新討論串1/1
各位版友們晚安 小的最近需要作lentivirus infection 所以使用了NEB stable competent cell (C3040) 作為vector 轉入之菌種 以避免重組現象的發生 但由於之前在別的Lab都是使用Ecos的stbl3 想知道NEB這個competent cell: 1.protocol建議是plate 養30度24小時 或37度o/n 但他又說37度有機率突變 是說在37養太久就會突變嗎? 或是這類的只要養在37度 不論時間都有可能得到錯誤的序列? 2.culture medium 需要用 TB / LB? 以及時間? plate目前我自己是養30度18h (LB/amp plate) 就有看到菌落 但拿去抽mini (30度24h, 2ml , LB/Amp medium) 濃度很低 總共大約1ug而已, plasmid ~8k 大 (目前是暫時夠我用，我只是怕到時抽midi產量一樣這麼低) 而NEB的網頁全都只有寫到plate o/n這步驟...後續都沒有提及 若有使用過這株菌的板友們 希望能給小的一些建議 謝謝各位 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.193.43.81 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1518360896.A.B20.html
推
02/12 08:31, 7年前 , 1F
影響序列容不容易有突變是因細菌分裂過快，導致你原本
02/12 08:31, 1F
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02/12 08:31, 7年前 , 2F
放入的序列會因細菌裡一些酵素而改變。就我之前看過的
02/12 08:31, 2F
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02/12 08:31, 7年前 , 3F
文獻跟自身經驗，溫度影響序列的因素遠大於養菌時間，因
02/12 08:31, 3F
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02/12 08:31, 7年前 , 4F
此如果你的序列在E.coli極不穩定，是有可能在37度下培養
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02/12 08:31, 7年前 , 5F
發生突變，因此面對像lentivirus這類有重複序列，還是
02/12 08:31, 5F
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02/12 08:31, 7年前 , 6F
建議先從30度或更低溫度下手。至於時間問題，是當你的
02/12 08:31, 6F
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02/12 08:31, 7年前 , 7F
細菌真的培養太久(兩天以上)，細菌可能因環境壓力而導致
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02/12 08:31, 7年前 , 8F
修剪序列。另外培養液/基建議使用LB即可，不建議用TB也
02/12 08:31, 8F
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02/12 08:31, 7年前 , 9F
是考慮避免細菌增值過快。基本上降低溫度就會降低菌內pl
02/12 08:31, 9F
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02/12 08:31, 7年前 , 10F
asmid的copy number，因此你萃取出的量就會不多，若需
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02/12 08:31, 7年前 , 11F
更多量請放大養菌量。
02/12 08:31, 11F
推
02/12 09:06, 7年前 , 12F
有些lentiviral vector極不穩定,transform一批可以
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02/12 09:07, 7年前 , 13F
有20%以上產生重組(非文獻,自己的經驗),這類的copy
02/12 09:07, 13F
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02/12 09:08, 7年前 , 14F
就是很低,但抽質體的重點在於正確不在多,用midi回溶
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02/12 09:08, 7年前 , 15F
少一點也夠你用的
02/12 09:08, 15F
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02/12 09:09, 7年前 , 16F
我也做過穩定的lentivector,1uL就有1ug,嚇死人
02/12 09:09, 16F
感謝A大跟J大的詳細說明! 所以倘若已使用30度來culture, 仍會建議在抽完plasmid後 做整個plasmid的sequence嗎? (我家也是第一次用這個vector) ※ 編輯: tynse71864 (140.109.113.61), 02/12/2018 14:27:24
推
02/12 14:56, 7年前 , 17F
我們主要發生的問題是recombination,跑電泳即可知道
02/12 14:56, 17F
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02/12 14:57, 7年前 , 18F
也可以跑電泳+設計限制酶切位會更安心
02/12 14:57, 18F
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02/12 14:57, 7年前 , 19F
當然預算沒問題就定序也行啦,不過就要等兩天才能用
02/12 14:57, 19F
推
02/12 18:11, 7年前 , 20F
預算、時間夠就定序吧，以免有任何不確定性在
02/12 18:11, 20F
推
02/25 11:57, 7年前 , 21F
使用上有疑問可致電諾貝爾詢問喔，請產專幫您解決
02/25 11:57, 21F
後來送全序列定序，皆與當初設計的相同 謝謝熱心的版友們! ※ 編輯: tynse71864 (114.137.83.94), 02/28/2018 20:37:54
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02/28 21:37, 7年前 , 22F
Ecoli transformation的過程幾乎不會有單一ATCG的突變啦
02/28 21:37, 22F
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02/28 21:37, 7年前 , 23F
這裡講突變,像是說某某菌容易突變,指的都是序列發生重組
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02/28 21:41, 7年前 , 24F
跟PCR不同,聚合欅在超長片段的突變,才會在nuclotide層次
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02/28 21:45, 7年前 , 25F
所以對於viral vector只有透過PCR增減的片段才需要訂序
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02/28 21:47, 7年前 , 26F
單純的transfrom只需要用酵素看切出的pattern即可
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02/28 21:49, 7年前 , 27F
最好是用切出3~5片段的酵素組合,不適合只用單一切點觀察
02/28 21:49, 27F
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02/28 21:51, 7年前 , 28F
而且每次重新transform都要做,因為上面joseph提到的狀況
02/28 21:51, 28F
因為沒做過這種 vector ,前段時間又卡在很基本的cloning……有點怕到 就直接送 seq了 下次我建立我會直接用 RE切來確認 ，謝謝 B大 ※ 編輯: tynse71864 (223.136.213.163), 03/16/2018 09:18:46
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