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[求救] Parental篩選不死

看板Biotech (生命科學)作者 (雷菜包)時間7年前 (2018/02/12 00:07), 7年前編輯推噓1(1推 0噓 21→)
留言22則, 5人參與, 7年前最新討論串1/1
想請問板上的大大們 小弟我最近在做Lentivirus transfection 但是轉染完後做puromycin篩選時 我的parental細胞都不太死 反而是有轉染的細胞死的還比較多 我已經做第二次了還是類似的結果 請問我的問題可能出在哪 有任何比較合理的解釋嗎 或是可以怎麼解決呢 感恩各位 ----- Sent from JPTT on my Asus ASUS_Z017DA. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.51.183 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1518365262.A.082.html
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02/12 09:10, 7年前 , 1F
做lenti前你要先準備好篩選條件,先測試puro在你們的
02/12 09:10, 1F
有 我有先做MTT assay 但我一開始選用的濃度跟這次篩選情況一樣 甚至我還提高puromycin濃度 但還是一樣 還是我的問題可能出在我的MTT assay
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02/12 09:10, 7年前 , 2F
細胞裡的dose再來談lenti的dose
02/12 09:10, 2F
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 02/12/2018 13:07:46
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02/12 14:10, 7年前 , 3F
標題得改一下
02/12 14:10, 3F
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 02/12/2018 21:15:26
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02/13 18:52, 7年前 , 4F
我其實是說標題的格式啦XDD
02/13 18:52, 4F
怎麼弄?? ※ 編輯: sean831009 (120.126.104.55), 02/14/2018 00:56:40
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02/14 08:35, 7年前 , 5F
少了一個空格 跟其他人要對齊
02/14 08:35, 5F
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 02/22/2018 20:59:26
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02/22 21:29, 7年前 , 6F
看不懂對你joseph回覆;到底一開始選用的濃度細胞死光了沒?
02/22 21:29, 6F
沒有 ※ 編輯: sean831009 (120.126.106.62), 02/24/2018 03:12:40
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03/18 23:48, 7年前 , 7F
parental 的問題有可能你puromycin的濃度不夠，所以殺不
03/18 23:48, 7F
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03/18 23:48, 7年前 , 8F
死，建議再測一次IC50。至於你的轉染細胞死一堆有可能是
03/18 23:48, 8F
我MTT assay已經又重做一次了 結果parental有死一些 但大部分還是貼著繼續長 我在想會不會是package的問題 可能送進去的質體量不夠 但從我的結果看來 如果我沒有package成功 我轉染應該也不會成功 但parental就是不死 或是你可以提供protocol嗎 我想比較一下謝謝
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03/18 23:48, 7年前 , 9F
轉染沒有成功，加上轉染的壓力導致細胞變得脆弱
03/18 23:48, 9F
※ 編輯: sean831009 (120.126.51.183), 03/19/2018 10:50:12
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03/20 09:02, 7年前 , 10F
一開始選用的濃度,對細胞都細胞沒有毒性了,跟質體,package
03/20 09:02, 10F
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03/20 09:02, 7年前 , 11F
有什麼關係?
03/20 09:02, 11F
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03/20 09:04, 7年前 , 12F
別管MTT,別管轉染了,好好的"只"檢查puro對操作細胞的IC50
03/20 09:04, 12F
但是加不同濃度的puro不是就是MTT嗎? 我的意思是原本測IC50會死的濃度 等我加了protamine sulfate之後再用原本IC50的puro濃度就不會死了
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03/20 09:04, 7年前 , 13F
應該不麻煩吧？
03/20 09:04, 13F
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03/20 09:07, 7年前 , 14F
只是細胞+不同濃度puro,連續三天顯微鏡觀察存活情況就好
03/20 09:07, 14F
推
03/20 23:54, 7年前 , 15F
哪種細胞阿？ 有些細胞本身對 puro非常有抗性，所以才
03/20 23:54, 15F
B16F10 murine melanoma cell 但我已經看過他對puro沒有抗性啊
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03/20 23:54, 7年前 , 16F
怎麼差都殺不死 (我目前也遇到)
03/20 23:54, 16F
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03/20 23:59, 7年前 , 17F
同 B大，不用管看 MTT 了；測試2,4,6,8,10 ug/ml看看
03/20 23:59, 17F
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03/20 23:59, 7年前 , 18F
哪時候會死
03/20 23:59, 18F
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03/20 23:59, 7年前 , 19F
如果都不會死可能是 1.你細胞本身就抗puro,需要別種的
03/20 23:59, 19F
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03/20 23:59, 7年前 , 20F
selection marker; 這個資料可以在 ATCC找，通常是最
03/20 23:59, 20F
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03/20 23:59, 7年前 , 21F
初 immortalize時篩選用的 2.puro壞了
03/20 23:59, 21F
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03/21 00:00, 7年前 , 22F
理論上 parental應該要幾乎全死
03/21 00:00, 22F
※ 編輯: sean831009 (211.21.125.231), 06/15/2018 16:36:49 ※ 編輯: sean831009 (211.21.125.231), 06/15/2018 16:39:35
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