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[求救] Linker活化、EDC/NHS、antibody鍵結問題

看板Biotech (生命科學)作者 (E-sou )時間7年前 (2018/05/16 18:22), 編輯推噓6(6推 0噓 17→)
留言23則, 7人參與, 6年前最新討論串1/1
大家好，小弟想問一下Linker活化、並鍵結抗體的相關問題 先簡述我的實驗步驟： 1.在金層上利用Au-S 鍵結SAMs層(使用Linker為8-巯基辛酸)，末端為COOH 2.利用EDC/NHS活化Linker 3.滴定抗體使抗體鍵結於Linker上。 爬了版上另一篇詢問的文章以及學長論文得知 EDC和NHS是活化COOH基用的，EDC先和COOH基反應，然後再由NHS和這個基團反應， :: 最後變成 R-C=O -NHS的反應基團，接下來就可以和帶有 R2-NH2的基團反應 論文中是寫EDC/NHS改質Linker的羧基COOH，使其易與抗體的胺基產生肽鍵。 如果以上沒錯的話代表Linker是與抗體的NH2反應，可是抗體的NH2鍵長在Y字型的 上面兩個點，那裏同時也是抗原進行專一性鍵結的地方， 這樣不就代表抗體應該是倒插在我的SAMs層上嗎?，為什麼文獻都是畫正的Y呢? 目前的猜想是所謂的NH2只是抗體重鏈中的某個側鏈，而不是Y頂端的抗原結合點 沒有生物化學背景來這邊問問題商大家的眼睛了抱歉， 煩請大大願意耐心幫我解答一下，謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.39.58 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1526466139.A.120.html
推
05/16 19:42, 7年前 , 1F
隨機方向鍵結到SAM
05/16 19:42, 1F
→
05/16 20:40, 7年前 , 2F
所以的確是與抗體中的NH2鍵結，但是是隨機方向的NH2囉?
05/16 20:40, 2F
推
05/16 20:56, 7年前 , 3F
抗體上有太多可以反應的地方
05/16 20:56, 3F
推
05/17 01:20, 7年前 , 4F
隨機插上所有的N-ter跟lysine/arginine的side chain
05/17 01:20, 4F
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05/17 01:20, 7年前 , 5F
當然機率是一個 構型也要考慮
05/17 01:20, 5F
→
05/17 13:30, 7年前 , 6F
那文獻中抗體都是Y字型插在表面只是方便示意而以囉?實際上
05/17 13:30, 6F
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05/17 13:30, 7年前 , 7F
不一定是這個方向
05/17 13:30, 7F
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05/17 13:31, 7年前 , 8F
想在請問一下除了螢光外，有什麼方式可以確認抗體OR抗原
05/17 13:31, 8F
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05/17 13:32, 7年前 , 9F
有佈植上去呢? 單純顯微鏡可嗎?目前是想用XPS看表面元素
05/17 13:32, 9F
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05/18 00:08, 7年前 , 10F
顯微鏡可以啊 跑一張IF
05/18 00:08, 10F
推
05/25 07:58, 7年前 , 11F
EDC NHS 就是做amide bond形成在用 主要形成diimide
05/25 07:58, 11F
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05/25 07:59, 7年前 , 12F
再被有親核劑攻擊 形成新的bond
05/25 07:59, 12F
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05/25 07:59, 7年前 , 13F
簡單說就是可以加快反應用的
05/25 07:59, 13F
推
06/13 00:39, 7年前 , 14F
隨機接 所以會東倒西歪 Y字型朝上只是好看用的
06/13 00:39, 14F
推
07/20 12:46, 6年前 , 15F
定性的話，可以用 cd spectrum 去測你純化後的產物有沒
07/20 12:46, 15F
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07/20 12:46, 6年前 , 16F
有抗體的訊號。
07/20 12:46, 16F
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07/20 12:46, 6年前 , 17F
另外，如果你做的東西是particles,粒徑至少要大於50~100
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07/20 12:46, 6年前 , 18F
nm，可先利用EDC/NHS有螢光的抗體接上後，再用confocal
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顯微鏡看螢光影像。
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07/20 12:46, 6年前 , 20F
07/20 12:46, 20F
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07/20 12:46, 6年前 , 21F
要定抗體接上去的量，用protein assay，例如Bradford as
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07/20 12:46, 6年前 , 22F
say。
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07/20 12:47, 6年前 , 23F
然後這反應很毒..
07/20 12:47, 23F
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