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[求救] XbaI 限制酶digestion切不完整

看板Biotech (生命科學)作者 (葉綠體)時間7年前 (2018/03/16 17:53), 7年前編輯推噓4(4推 0噓 9→)
留言13則, 6人參與, 7年前最新討論串1/1
大家好! 最近我要做southern blot檢測轉殖株基因體內轉基因套數，但在digestion發生了問題! 由於老闆要求需要分別用三個不同限制酶檢測套數，於是我選用了EcoRI, BamHI及XbaI。 前兩個酵素都很成功的將不同轉殖株wild type和positive control 之15 ug DNA切割成s mearing條帶，但XbaI卻在少數三管DNA (包含wild type, 如下圖 5th, 10th, 25th well ) digested不完全, 因此想求助大家原因出在哪裡? 謝謝大家! https://i.imgur.com/1d8WgEc.jpg
以下附上digestion 條件 DNA 15 ug 10X buffer Tango 2 ul Fermentas XbaI (10U/ul) 2 ul 補dH2O至體積為20 ul 37℃ 16小時 註: 1. 三支酵素digestion條件完全相同,差別只在使用的buffer種類不同 2.皆使用同一管DNA -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.190.247 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1521194033.A.B4F.html
推
03/16 18:12, 7年前 , 1F
DNA methylation? 找一個沒有methylation影響的酵素
03/16 18:12, 1F
→
03/16 18:12, 7年前 , 2F
吧~
03/16 18:12, 2F
推
03/16 19:42, 7年前 , 3F
xbai 有些會有甲基化喔 會切不動
03/16 19:42, 3F
→
03/17 00:09, 7年前 , 4F
XbaI要注意用的菌種，methylation後會切不動
03/17 00:09, 4F
推
03/17 00:29, 7年前 , 5F
XbaI遇到methylation 就且不動喔 換菌種看看
03/17 00:29, 5F
謝謝大家的回應，但昨天我換了一支酵素NEB的PvuII，切 1 ug DNA，其他條件相同， 仍然切不動。有查過NEB網站確認過PvuII不會受甲基化影響，請問會是什麼原因? ※ 編輯: fishg1216 (140.120.190.245), 03/17/2018 12:39:26
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03/17 12:41, 7年前 , 6F
03/17 12:41, 6F
推
03/17 13:31, 7年前 , 7F
有沒有Non-digested作為control?
03/17 13:31, 7F
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03/18 16:40, 7年前 , 8F
XbaI是對dam敏感,但你的轉殖株應該沒有這種methylase吧
03/18 16:40, 8F
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03/19 11:21, 7年前 , 9F
to j大，不好意思沒做cotrol; to b大，怎樣確認有無
03/19 11:21, 9F
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03/19 11:21, 7年前 , 10F
此methylase? 謝謝!
03/19 11:21, 10F
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03/19 12:24, 7年前 , 11F
我是回應前面推文都提到菌種,可是你只提到轉殖株,沒說是菌
03/19 12:24, 11F
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03/19 12:26, 7年前 , 12F
Ecoli才有dam,就算XbaI對dam敏感,也要看你用轉殖株是什麼
03/19 12:26, 12F
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03/21 18:05, 7年前 , 13F
轉殖株材料是番茄
03/21 18:05, 13F
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